La fiabilité des résultats dans les expériences de la métabolomique dépend de l'efficacité et la reproductibilité de la préparation de l'échantillon. Décrit une méthode rigoureuse et en profondeur qui permet l'extraction de métabolites à partir de fluides biologiques avec l'option de la suite à l'analyse des milliers de composés, ou seulement les classes de composés d'intérêt.
La métabolomique est un domaine émergent qui permet le profilage des échantillons d'organismes afin d'obtenir un aperçu des processus biologiques vivantes. Un aspect essentiel de la métabolomique est la préparation des échantillons de sorte que les techniques incompatibles génèrent des résultats peu fiables. Cette technique comprend la précipitation des protéines, de l'extraction liquide-liquide, et l'extraction en phase solide comme moyen de fractionnement de métabolites en quatre classes distinctes. Amélioration de l'enrichissement de molécules de faible abondance avec une augmentation résultante de la sensibilité est obtenue, et aboutit finalement à l'identification de molécules plus confiant. Cette technique a été appliquée au plasma, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, et des échantillons de liquide céphalorachidien avec des volumes aussi faibles que 50 ul. Les échantillons peuvent être utilisés pour de multiples applications en aval; par exemple, le culot résultant de la précipitation des protéines peut être stockée pour une analyse ultérieure. Le surnageant de cette étape est soumis à une extraction liquide-liquide à l'aidel'eau et un solvant organique solide pour séparer les composés hydrophiles et hydrophobes. Une fois fractionné, la couche hydrophile peut être traité pour une analyse ultérieure ou jeté s'il n'est pas nécessaire. La fraction hydrophobe est en outre traité avec une série de solvants au cours de trois étapes d'extraction en phase solide pour la séparer en acides gras, des lipides neutres et des phospholipides. Cela permet au technicien la possibilité de choisir la classe de composés est préféré pour analyse. Il contribue également à l'identification des métabolites plus fiable, car une certaine connaissance de la classe chimique existe.
Générer des métabolites des réactions biologiques en tant que produits finaux de processus cellulaires. La métabolomique est une collection de tous les composés présents dans l'organisme à la suite de ces procédés. Il donne une image de la physiologie des cellules et reflète la réponse de l'organisme à des stimuli externes ou internes 1, 2. Ces stimuli peuvent être environnementales, toxicologiques, pharmacologiques, alimentaires, hormonaux, ou liées à une maladie. De nombreuses applications ont métabolomique et sont actuellement à l'étude par des chercheurs et notamment la découverte de biomarqueurs 3, 4 études sur la nutrition, sciences de l'alimentation 5, et le dépistage des drogues 6. Quelle que soit l'application, les variations de données, la contamination et la présence de faux-positifs doivent être réduite ou de préférence éliminée. Dans la découverte de biomarqueurs ou dans le cas de la détermination des différences entre un témoin et un groupe de maladie, ou d'enquêter sur les effets des médicaments sur des sujets, une f biologiqueLUID est choisi sur la base des questions posées et les types de métabolites à l'étude 7. Par exemple, si l'étude des effets immédiats d'un médicament inhalé sur les poumons des asthmatiques, alors explorer métabolites dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA) des échantillons avant et après l'administration serait préférentiel. Afin de s'assurer que les différences observées sont dues à la variation biologique réelle plutôt que mauvaise technique de préparation des échantillons, le protocole de laboratoire normalisée et cohérente est essentielle 8. Exemple d'informations doit être soigneusement documenté afin de s'assurer que les variables tels que le liquide biologique, souche animale, le temps d'échantillonnage, l'âge du sujet, le sexe, pour n'en nommer que quelques-uns, sont tous considérés et pris en compte dans l'étude 9. En outre, pour réduire la possibilité de contamination ou de faux positifs, il est recommandé de flans ébauches de solvants et de l'instrument d'analyser 10.
Pour ce protocole, le terme «métabolismelites »seront utilisés pour désigner les composés réels identifiés. Utiliser un logiciel de fournisseur, un algorithme initial de pointe de recherche est utilisé pour détecter des pics de spectrométrie de masse. Ces pics sont alignés sur la base de (m / z) rapport et rétention de masse à temps de charge. Un deuxième algorithme est ensuite utilisé pour combiner plusieurs fonctions dans un seul composé. Cela comprend des caractéristiques telles que le sodium, le potassium, ou des produits d'addition d'ammonium dans le mode d'ionisation positif et de chlorure dans le mode ion négatif. Des options supplémentaires dans le logiciel incluent des fonctionnalités telles que les dimères et d'autres produits d'addition. Utilisation de glucose, par exemple, avec des pics à 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH 4), et 203,05261 m / z (M + Na), il y aura trois pics correspondant à la même composer à l'aide du premier algorithme. Cependant, lorsque le second algorithme, qui est basé sur la formule moléculaire, on applique ces trois produits d'addition deviennent regroupés en un composé résultant.
Métabolites peuvent causer des interférences dans samples en raison de la complexité des composés présents. La présence de milliers de métabolites dans un échantillon causes signal de suppression notamment des métabolites de faible abondance. le nettoyage de l'échantillon pour éliminer les protéines interférant, et une séparation ultérieure en plusieurs fractions réduit la complexité de l'échantillon ce qui améliore la séparation des pics, ce qui augmente la résolution, et la réduction de métabolite co-élution. Par conséquent, le nettoyage de l'échantillon et une meilleure séparation des composés est nécessaire. Il a été montré que la précipitation des protéines seules, même avec l'utilisation de différents solvants de polarité, ne peut résoudre ce problème 11, 12. Cependant, par combinaison d'un solvant organique forte telle que le MTBE avec une étape de fractionnement ultérieure, la couverture de métabolite est augmentée. Yang et al. 12 ont signalé une augmentation des métabolites de 1851 ou 2073 avec du méthanol ou de précipitation méthanol-éthanol seuls respectivement, à 3,806 métabolites utilisant MTBE combinée extraction par solvantsuivie d'une extraction en phase solide (SPE) étapes. Réduit le chevauchement de métabolite, l'amélioration de la séparation de pic et une abondance accrue de metabolites a été observée avec cette méthode.
Contamination de non-métabolites, tels que les polymères, peut entraîner de la collecte de l'échantillon, de solvants ou de bruit de l'instrument, et peut conduire à la suppression du signal de métabolites potentiellement importants. Il est recommandé que le technicien (s) et ceux qui collectent les échantillons avant de goûter à la préparation utiliser toujours la même marque, le type et la taille des flacons de prélèvement d'échantillons, embouts de pipette et tous les autres tubes utilisés lors de la collecte et la préparation des échantillons. Cela permet à l'analyste de données pour avoir pleine confiance que les changements observés sont réels et non en raison de différences de fond provenant d'autres sources. L'efficacité du traitement, les variations entre la maladie et les groupes de contrôle, ou d'autres analyses métaboliques peuvent alors être étudiées avec une confiance accrue.
La method discuté ici se concentre sur l'échantillon des méthodes de préparation combinées 13-15 qui peuvent être appliqués à plasma, BALF, ou le liquide céphalorachidien (LCR) des échantillons de profilage métabolomique non ciblée pour la spectrométrie de chromatographie liquide de masse (LCMS) l'analyse comparative. Les deux Chromatographie liquide (LC) et la Chromatographie liquide ultra performance (UPLC) des techniques de séparation peuvent être couplés à MS après cette procédure. De nombreux chercheurs effectuant métabolomique utilisent soit une technique de précipitation des protéines et / ou d'une technique d'extraction liquide-liquide 16, 17. Dans nos études, ce qui a entraîné en moins de métabolites détectés. Le procédé décrit ici 12 permet la détection et l'identification d'un plus grand nombre de métabolites, couvrant une large gamme de métabolome. Cette augmentation est due à la plus grande pureté des échantillons et des effets de matrices réduites provoquées par la séparation préalable des classes de metabolites.
Une prot initialeein étape de précipitation est effectuée en utilisant du methanol froid (MeOH) pour éliminer les protéines de l'échantillon. Extraction liquide-liquide (LLE) en utilisant de l'éther de tert-butyle et de méthyle (MTBE) et de l'eau est utilisée pour séparer les composés hydrophiles et hydrophobes. Ensuite, l'extraction en phase solide (SPE) est effectuée sur la couche hydrophobe afin de séparer les composés hydrophobes en trois classes – des acides gras, des lipides neutres et des phospholipides. Les fractions hydrophobes sont reconstitués dans 100% de methanol, tandis que la fraction hydrophile est reconstituée dans 5% d'acétonitrile dans l'eau. L'extraction en phase solide (SPE) étape fournit un niveau supplémentaire de confiance dans les résultats en réduisant le nombre de composés coélution qui autrement serait présent avait une étape de séparation pas été effectuée.
Un des objectifs de métabolomique clinique est d'identifier les changements dans le métabolome liée à la maladie ou des traitements. Par conséquent techniques de préparation des échantillons doivent être robustes, cohérente et transférable de technicien à technicien et d'un laboratoire à 22. Les données résultant doit être représentative de l'échantillon, et les changements identifiés doivent refléter l'échantillon plutôt que de définir les erreurs de préparation des échantillons. Par conséquent pipetage précis, bonne température, décantation efficace des couches non miscibles, séchage sous azote, et l'utilisation des mêmes marques et les tailles de la verrerie et des conseils sont nécessaires.
Au cours de l'étape de précipitation de protéine, il est essentiel que la même quantité de solution est décantée à partir de chaque pastille. Cela permet de réduire la variation de volume et en tant que tel réduit la variation dans les données d'échantillon. Cette étape de précipitation de protéine est nécessaire pour la métabolomique et ne peut pas être ignoré car il supprime la protéine à partir deles échantillons avant l'analyse de profilage petite molécule sur le spectromètre de masse. Il élimine les agents pathogènes et les grandes macromolécules, et libère lié métabolites de protéines 7. L'absence d'accumulation de la protéine dans les échantillons étend la durée de vie de la colonne HPLC et augmente la précision et la qualité des résultats. Figure 5 est une représentation du culot protéique formé lors de l'exécution de cette technique à des échantillons de plasma. Ceci permet la détection de petites molécules, augmente l'abondance d'ions, et réduit les effets de matrice de protéines dans l'échantillon. En outre, étant donné que l'on suppose que toutes les protéines sont éliminées à cette étape, les acides aminés qui sont détectées lors de l'analyse LC-MS proviendraient des changements métaboliques et non à partir de la dégradation des protéines.
L'étape d'extraction liquide-liquide est essentielle car elle sépare les metabolites hydrophiles et hydrophobes en deux couches non miscibles. Figure 6 montre la procédure LLE et un repsentation de la couche LLE. Une mauvaise séparation des deux couches en résulte métabolites étant soit perdu ou être élues dans les deux fractions. Application rigoureuse de cette étape réduit le nombre de composés hydrophiles qui apparaissent dans la fraction hydrophobe. Les résultats obtenus pour ces composés deviennent peu fiables, car il est impossible de déterminer quelle fraction contient les résultats représentatifs. Une fois fait correctement, métabolite chevauchement est réduite.
Pour éviter une dégradation par oxydation, en particulier dans les lipides, mais également en petites molécules qui peuvent contenir des groupes thiol, par exemple, l'exposition à l'oxygène doit être maintenu à un minimum. Par conséquent, cette procédure est toujours effectuée sous atmosphère d'azote afin de réduire / prévenir l'oxydation des lipides ou des composés contenant un thiol. En outre, le transfert de l'échantillon et / ou de la solution est rapide (dans la première minute) pour réduire l'exposition à l'oxygène, des échantillons sont rapidement placés sous un courant constant d'azote à sécher. Une fois séchés, ils sont immédiatementment remis en suspension dans 100% de méthanol pour les raisons ci-dessus évoquées.
Les laboratoires peuvent bénéficier de cette méthode globale dans un certain nombre de façons; Les chercheurs cherchent à isoler une classe de composés peuvent choisir la partie de la méthode qui convient le mieux à leurs besoins. Ceux qui cherchent à effectuer seulement une précipitation des protéines à obtenir un pool de métabolites peuvent le faire. Si les métabolites hydrophiles sont souhaités, tels que de nombreux produits pharmaceutiques, des acides aminés et des sucres, ou si seulement les métabolites hydrophobes sont souhaitées, telles que les triglycérides, les époxydes, les vitamines liposolubles, et les phospholipides, par exemple, les chercheurs peuvent effectuer l'extraction liquide-liquide l'étape suivante précipitation des protéines et jetez la fraction indésirable. Les enquêteurs qui ont besoin de davantage de sous-classification des composés hydrophobes (lipides neutres, des acides gras, phospholipides) et peuvent passer à l'étape de fractionnement.
Les conditions de conservation sont importantes dans maintaining de la viabilité des échantillons pour une analyse ultérieure. Si les échantillons sont stockés de manière incorrecte, la dégradation ou la décomposition peuvent se produire. Idéalement, les échantillons doivent être conservés dans des flacons ambrés de bouchon à vis loin de la lumière pour éviter la dégradation des espèces sensibles à la lumière. Les échantillons doivent être conservés congelés à -80 ° C pour éviter la dégradation de métabolite 23-25. Bien que n'étant pas décrit en détail ici, les échantillons sont toujours conservés à 4 ° C dans le plateau d'auto-échantillonneur pendant l'analyse LC-MS. Cela garantit que tous les échantillons sont maintenus à une température constante et que les variations de la température ambiante n'affectent pas la viscosité, la solubilité, la stabilité ou des échantillons. Il est recommandé que les aspects manuels de cette procédure, comme LLE et SPE, être pratiquées afin de gagner la confiance et le confort avec les étapes.
Quelques limitations existent pour cette technique. Séparation discrète des métabolites hydrophobes et hydrophiles n'est pas garanti que certains composés sera inherpartitionner ently en deux fractions en raison de leur état de composition chimique et de la charge. En outre, comme indiqué sur la figure 4, une mauvaise technique au cours de l'étape d'extraction des protéines de granule peut entraîner une mauvaise reproductibilité des métabolites dans les deux échantillons et des contrôles de qualité. Cela affecte les statistiques, en particulier dans les petits jeux de données parce que la puissance statistique n'est pas disponible. Il est donc crucial que cette étape sera effectuée exactement au même moment chaque pour chaque échantillon. Une autre limite est le temps. Bien qu'il existe des points d'arrêt tout au long de ce protocole où les échantillons peuvent être congelés et la préparation a continué le lendemain, une journée entière devrait être mis de côté pour effectuer cette procédure. En troisième lieu, et non pas chaque composé au sein d'un échantillon biologique peut être évalué pour la suppression d'ions. Comme il n'est pas possible d'identifier la façon dont la matrice affecte chaque metabolite particulier, l'option courante est d'évaluer les étalons internes qui miment théoriquement certaines classes de endogenous métabolites. Enfin, les identifications absolus ne peuvent pas être effectués exclusivement avec cette méthode. Tandem MS en collaboration avec les recherches et les normes de base de données sont nécessaires pour l'identification des métabolites absolue.
Une partie importante de la métabolomique est l'identification des composés. Bien que n'étant pas décrit en détail ici, les échantillons de contrôle de qualité ont été analysés par LC-MS. Plusieurs ébauches de préparation des échantillons et des blancs de l'appareil ont été préparés pour servir de fond soustraction de réduire le taux de faux positifs de contaminants, ce qui entraîne dans les coups de métabolites plus fiables. Après cette étape, le nombre de «caractéristiques moléculaires" ont été regroupés en fonction de m / z, temps de rétention, rapport isotopique, et des produits d'addition pour produire une liste de composés réels. Bien que la liste des composés a été considérablement réduit, les résultats sont plus fiables car ils ne sont pas fondées sur plusieurs produits d'addition de la même composé. La méthode complète est complet et permet isolation de métabolites hydrophobes tels que des lipides neutres, des phospholipides, des acides gras, des triglycérides, et les stéroïdes, tout en isolant également les classes hydrophiles dans la fraction aqueuse, dont les eicosanoïdes, les sucres, les flavonoïdes et les acides aminés ont été identifiés 12, 26.
The authors have nothing to disclose.
Le tutoriel présenté a été réalisé et développé dans le Core Facility spectrométrie de masse de Santé national juif. L'installation NJH MS est financé en partie par le CCSTI UL1 TR000154. Le financement de subventions des NIH P20 HL-113445 et R01 HL-095432 également soutenu ce travail.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |