L'affidabilità dei risultati in esperimenti di metabolomica dipende l'efficacia e la riproducibilità della preparazione del campione. Descritto è un metodo rigoroso e approfondita che consente l'estrazione di metaboliti da fluidi biologici con possibilità di analizzare successivamente fino a migliaia di composti, o solo le classi di composti di interesse.
Metabolomica è un settore emergente che consente la profilazione dei campioni da organismi viventi, al fine di ottenere la comprensione dei processi biologici. Un aspetto fondamentale della metabolomica è la preparazione del campione per cui le tecniche incoerenti generano risultati inaffidabili. Questa tecnica comprende la precipitazione delle proteine, estrazione liquido-liquido, e l'estrazione in fase solida come mezzo di frazionamento metaboliti in quattro classi distinte. Migliorata l'arricchimento di molecole a basso abbondanza con un conseguente aumento della sensibilità si ottiene, e in ultima analisi, l'identificazione più sicuri di molecole. Questa tecnica è stata applicata a plasma, fluido di lavaggio broncoalveolare, e campioni di liquido cerebrospinale con volumi a partire da 50 microlitri. I campioni possono essere utilizzati per molteplici applicazioni a valle; per esempio, il pellet risultante dalla precipitazione delle proteine possono essere memorizzati per una successiva analisi. Il supernatante dal fatto che la fase subisce estrazione liquido-liquido conacqua e forte solvente organico per separare i composti idrofili e idrofobi. Una volta frazionata, lo strato idrofilo può essere elaborato per una successiva analisi o scartato se non necessario. La frazione idrofoba è ulteriormente trattata con una serie di solventi durante tre fasi di estrazione in fase solida per separare in acidi grassi, lipidi neutri e fosfolipidi. Ciò consente al tecnico la possibilità di scegliere quale classe di composti è preferito per l'analisi. Essa aiuta anche nella identificazione del metabolita più affidabile dal momento che una certa conoscenza della esistenza classe chimica.
Reazioni biologiche generano metaboliti come prodotti finali di processi cellulari. Metabolomica è una raccolta di tutti i composti presenti in un organismo come risultato di questi processi. Esso fornisce un quadro della fisiologia delle cellule e riflette la risposta di un organismo a stimoli esterni o interni 1, 2. Tali stimoli possono essere ambientali, tossicologici, farmacologici, dietetici, ormonali, o correlati alla malattia. Molte applicazioni metabolomica hanno e sono attualmente allo studio da parte dei ricercatori e comprendono scoperta di biomarcatori 3, 4 studi di nutrizione, scienze alimentari 5 e droga test 6. Indipendentemente dall'applicazione, variazioni nei dati, contaminazione e presenza di falsi positivi devono essere ridotte o preferibilmente rimosso. Nella scoperta biomarker o in caso di determinazione delle differenze tra un controllo e un gruppo malattia, o studiare gli effetti di farmaci su soggetti, una f biologicoLUID viene scelta in base alle domande poste e le tipologie di metaboliti in fase di studio 7. Ad esempio, se studiando gli effetti immediati di un farmaco per via inalatoria sui polmoni degli asmatici, poi esplorando metaboliti nel liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) campioni prima e dopo la somministrazione sarebbe preferenziale. Per garantire che osservate differenze sono dovute alla variazione biologica effettivo anziché improprio tecnica di preparazione del campione, protocollo di laboratorio standardizzato e coerente è essenziale 8. Informazioni sul campione deve essere attentamente documentato per garantire che variabili come fluido biologico, ceppo animali, tempo di campionamento, età dei soggetti, di genere, per citarne alcuni, sono tutti considerati e presi in considerazione nello studio 9. Inoltre, per ridurre la possibilità di contaminazione o falsi positivi, si consiglia di sbozzati solvente e sbozzati strumenti analizzati 10.
Per questo protocollo, il termine metabolismo "lites "saranno utilizzati per riferirsi ai composti reali identificati. Utilizzando il software vendor, un algoritmo iniziale picco constatazione è utilizzato per rilevare i picchi spettrali di massa. Questi picchi sono allineati basato su massa e carica (m / z) rapporto e ritenzione tempo. Un secondo algoritmo viene poi usato per combinare più funzioni in un singolo composto. Questo include caratteristiche come sodio, potassio, ammonio o addotti nella modalità di ionizzazione positiva, e cloruro in modalità ioni negativi. Opzioni aggiuntive del software includono caratteristiche come dimeri e altri addotti. Utilizzando glucosio come esempio, con picchi a 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH 4), e 203,05,261 mila m / z (M + Na), ci sarebbero tre picchi dello stesso composti utilizzando il primo algoritmo. Tuttavia quando il secondo algoritmo, che si basa sulla formula molecolare, viene applicato questi tre addotti diventano raggruppate causando un composto.
I metaboliti possono causare interferenze all'interno di samples causa della complessità dei composti presenti. La presenza di migliaia di metaboliti in uno cause del campione segnalano in particolare la soppressione dei metaboliti abbondanza inferiori. Esempio di pulitura per rimuovere le proteine interferenti, e successiva separazione in più frazioni riduce la complessità del campione migliorando così la separazione dei picchi, aumentando la risoluzione, e riducendo metabolita coelution. Pertanto, è necessaria la pulizia del campione perfezionata separazione dei composti. E 'stato dimostrato che solo precipitazione proteica, anche con l'uso di vari solventi di polarità, non può risolvere questo problema 11, 12. Tuttavia, combinando un forte solvente organico come MTBE con una successiva fase di frazionamento, la copertura metabolita aumenta. Yang et al. 12 hanno riportato un aumento dei metaboliti da 1.851 o 2.073 con metanolo o metanolo, etanolo alone di precipitazione, rispettivamente, a 3.806 metaboliti mediante estrazione con solvente MTBE combinataseguita da estrazione in fase solida (SPE) passi. Sovrapposizione metabolita ridotti, migliore separazione dei picchi e maggiore abbondanza metabolita è stata osservata con questo metodo.
Contaminazione da non-metaboliti, come i polimeri, può derivare dalla raccolta del campione, solventi, o il rumore dello strumento, e può comportare la soppressione di metaboliti potenzialmente significative del segnale. Si raccomanda che il tecnico (s) e coloro che raccolgono i campioni prima della preparazione del campione coerente utilizzare la stessa marca, tipo e dimensione di fiale di raccolta del campione, puntali e eventuali altri tubi utilizzati durante la raccolta e la preparazione dei campioni. Questo permette l'analista dati per avere piena fiducia che i cambiamenti osservati sono reali e non a causa delle differenze di fondo provenienti da altre fonti. L'efficacia del trattamento, variazioni tra malattie e gruppi di controllo, o qualsiasi altra analisi metaboliche possono essere esaminati con maggiore fiducia.
Il method discusso qui si concentra sul campione metodi di preparazione combinati 13-15 che possono essere applicati al plasma, BALF, o nel liquido cerebrospinale (CSF) campioni per non mirato profiling metabolico per cromatografia-spettrometria di massa liquida (LCMS) analisi basata. Entrambi cromatografia liquida (LC) e cromatografia liquida ultra alta prestazione (UPLC) tecniche di separazione possono essere accoppiati a MS successivamente a tale procedura. Molti ricercatori che effettuano studi metabolomic utilizzano una tecnica di precipitazione delle proteine e / o una tecnica di estrazione liquido-liquido 16, 17. Nei nostri studi, questo ha portato ad essere rilevato un minor numero di metaboliti. Il metodo qui descritto 12 consente il rilevamento e l'identificazione di un maggior numero di metaboliti, che coprono una vasta gamma di metabolome. Tale incremento è dovuto alla maggiore purezza dei campioni e ridotti effetti matrice causati dalla prima separazione delle classi metaboliti.
Un prot inizialeein fase di precipitazione viene eseguita utilizzando metanolo freddo (MeOH) per rimuovere proteine dal campione. Estrazione liquido-liquido (LLE) usando metil tert-butil etere (MTBE) e acqua viene utilizzata per separare i composti idrofili e idrofobi. Quindi viene eseguita l'estrazione in fase solida (SPE) sullo strato idrofobo per separare i composti idrofobici in tre classi – acidi grassi, lipidi neutri e fosfolipidi. Le frazioni idrofobe vengono ricostituiti in metanolo 100%, mentre la frazione idrofila viene ricostituito in 5% acetonitrile in acqua. L'estrazione in fase solida (SPE) passo fornisce un ulteriore livello di fiducia nei risultati, riducendo il numero di composti che coeluiscono che sarebbero altrimenti presenti aveva una fase di separazione non è stata eseguita.
Uno degli obiettivi degli studi di metabolomica clinici è quello di identificare i cambiamenti nel metabolome correlate a malattie o trattamenti. Pertanto le tecniche di preparazione dei campioni devono essere robusti, coerente e trasferibile da tecnico di un tecnico e da laboratorio a laboratorio 22. I dati risultanti deve essere rappresentativo del campione, e le modifiche individuate bisogno di riflettere il campione set piuttosto che errori di preparazione del campione. Pertanto pipettaggio accurato, temperatura corretta, decantazione efficiente di strati immiscibili, essiccamento sotto azoto, e l'utilizzo delle stesse marche e dimensioni di vetro e suggerimenti sono necessari.
Durante la fase di precipitazione della proteina, è fondamentale che la stessa quantità di soluzione viene decantata da ciascun pellet. Questo riduce la variazione di volume e come tale riduce la variazione nei dati di esempio. Questa precipitazione passo proteina è necessaria per gli studi di metabolomica e non può essere saltata in quanto rimuove proteinei campioni prima piccola molecola profilatura analisi dello spettrometro di massa. Elimina gli agenti patogeni e le grandi macromolecole, e rilascia legato metaboliti dalle proteine 7. Mancanza di accumulo di proteine nei campioni espande la durata della colonna HPLC e aumenta la precisione e la qualità dei risultati. Figura 5 è una rappresentazione del pellet proteina formata durante l'esecuzione di questa tecnica su campioni di plasma. Questo permette la rilevazione di piccole molecole, migliora ione abbondanza, e riduce gli effetti matrice dalle proteine nel campione. Inoltre, poiché si presume che tutte le proteine vengono rimossi in questa fase, gli amminoacidi che vengono rilevati durante l'analisi LC-MS sarebbero provengono da cambiamenti metabolici piuttosto che dal catabolismo proteico.
La fase di estrazione liquido-liquido è critico poiché separa i metaboliti idrofili e idrofobi in due strati immiscibili. Figura 6 mostra la procedura LLE e un rappresentanteresentazione dello strato LLE. Una separazione improprio dei due strati si traduce in metaboliti o essere persi o essere diluiti in entrambe le frazioni. Attenta applicazione di questo passo riduce il numero di composti idrofili che appaiono nella frazione idrofoba. I risultati di questi composti non sono attendibili in quanto non è possibile stabilire quale frazione contiene i risultati rappresentativi. Se fatto correttamente, metabolita sovrapposizione è ridotta.
Per evitare la degradazione ossidativa, soprattutto in lipidi ma anche in piccole molecole che possono contenere gruppi tiolici per esempio, l'esposizione all'ossigeno deve essere mantenuto al minimo. Pertanto, questa procedura viene sempre eseguita sotto azoto per ridurre / impedire l'ossidazione dei lipidi o composti contenenti tiolo. Inoltre, il trasferimento del campione e / o la soluzione è rapido (entro il primo minuto) per ridurre l'esposizione all'ossigeno, poi i campioni sono rapidamente con un flusso continuo di azoto ad asciugare giù. Una volta essiccati, sono immediatamentediatamente risospese in 100% di metanolo per i motivi sopra discussi.
Laboratori possono beneficiare di questo metodo globale in diversi modi; I ricercatori cercano di isolare una classe di composti in grado di scegliere la parte del metodo che meglio si adatta alle loro esigenze. Coloro che cercano di eseguire solo una precipitazione di proteine per ottenere un pool di metaboliti possono farlo. Se metaboliti idrofili sono desiderati, come molti farmaci, amminoacidi e zuccheri, o se solo metaboliti idrofobici sono desiderati, quali trigliceridi, epossidi, vitamine liposolubili e fosfolipidi per esempio, allora i ricercatori possono eseguire l'estrazione liquido-liquido passo successivo precipitazione delle proteine e scartare la frazione indesiderato. Gli investigatori che necessitano di ulteriori sotto-classificazione dei composti idrofobici (lipidi neutri, acidi grassi e fosfolipidi) possono procedere alla fase di frazionamento.
Considerazioni di stoccaggio sono importanti in maintaining la vitalità dei campioni per un'analisi successiva. Se i campioni sono conservati in modo non corretto, possono verificarsi degradazione o decomposizione. Idealmente, i campioni devono essere conservati in flaconi color ambra con tappo a vite al riparo dalla luce per evitare il degrado di luce specie sensibili. I campioni dovrebbero essere conservati congelati a -80 ° C per evitare la degradazione del metabolita 23-25. Sebbene non discusso in dettaglio qui, i campioni sono sempre mantenuti a 4 ° C nel vassoio autocampionatore durante l'analisi LC-MS. Questo garantisce che tutti i campioni sono mantenuti ad una temperatura costante e che variazioni della temperatura ambiente non influenzano la viscosità, solubilità, stabilità o dei campioni. Si raccomanda che gli aspetti manuali di questa procedura, come LLE e SPE, essere praticate al fine di ottenere la fiducia e il comfort con le fasi.
Esistono alcune limitazioni per questa tecnica. Separazione discreto dei metaboliti idrofobiche e idrofiliche non è garantito come alcuni composti saranno inherdipendentemente suddividere in due frazioni a causa del loro stato di composizione chimica e la carica. Inoltre, come mostrato in Figura 4, la tecnica non corretta durante la fase di estrazione della proteina pellet può provocare scarsa riproducibilità metabolita in entrambi i campioni ed i controlli di qualità. Questo riguarda le statistiche, soprattutto in piccoli insiemi di dati, perché la potenza statistica non è disponibile. Pertanto è fondamentale che questo passo essere eseguita esattamente lo stesso tempo ogni per ogni campione. Un altro limite è il tempo. Anche se ci sono punti di arresto nel corso di questo protocollo in cui i campioni possono essere congelati e la preparazione proseguito il giorno seguente, un intero giorno dovrebbe essere accantonata per eseguire questa procedura. In terzo luogo, non tutti i composti in un campione biologico può essere valutato per soppressione ionica. Poiché non è possibile identificare come la matrice colpisce ogni singolo metabolita, l'opzione corrente è di valutare gli standard interni che teoricamente imitano alcune classi di endogenous metaboliti. Infine, identificazioni assoluti non possono essere eseguite solo con questo metodo. Tandem MS in collaborazione con le ricerche di database e gli standard sono necessari per l'identificazione del metabolita assoluta.
Una parte importante della metabolomica è l'identificazione dei composti. Sebbene non discusso in dettaglio qui, campioni di controllo di qualità sono stati analizzati utilizzando la LC-MS. Più spazi di preparazione dei campioni e gli spazi strumenti sono stati preparati per uso come sfondo sottrazione di ridurre il tasso di falsi positivi da contaminanti, ottenendo in tal modo risultati metaboliti più affidabili. A seguito di questa fase, il numero di "caratteristiche molecolari" quasi raggruppati sulla base di m / z, tempo di ritenzione e il rapporto isotopico, e addotti per produrre un elenco di composti effettivi. Anche se l'elenco dei composti è stata notevolmente ridotta, i risultati erano più affidabili in quanto non erano basati su più addotti dallo stesso composto. Il metodo completo è completo e permette isolation di metaboliti idrofobici quali lipidi neutri, fosfolipidi, acidi grassi, trigliceridi, e steroidi, mentre anche isolando classi idrofili nella frazione acquosa, di cui eicosanoidi, zuccheri, flavonoidi e aminoacidi sono stati identificati 12, 26.
The authors have nothing to disclose.
Il tutorial presentato è stato eseguito e sviluppato all'interno del Nucleo strumento spettrometria di massa al National Jewish Health. La struttura njh MS è sostenuto in parte da CCSTI UL1 TR000154. Finanziamento da sovvenzioni NIH P20 HL-113445 e R01 HL-095432 supportata anche questo lavoro.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |