A confiabilidade dos resultados em experimentos de metabolômica depende da eficácia e reprodutibilidade da preparação de amostras. Descrito é um método rigoroso e em profundidade que permite a extração de metabólitos a partir de fluidos biológicos com a opção de seguida, analisar-se a milhares de compostos, ou apenas as classes de compostos de interesse.
Metabolomics é uma área emergente que permite perfis de amostras a partir de organismos vivos, a fim de obter uma visão sobre processos biológicos. Um aspecto vital da metabolômica é a preparação da amostra em que técnicas inconsistentes gerar resultados não confiáveis. Esta técnica envolve a precipitação de proteínas, a extracção líquido-líquido, e de extracção em fase sólida como um meio de fraccionamento de metabolitos em quatro grupos distintos. Melhoria enriquecimento de moléculas de baixa abundância, com conseqüente aumento na sensibilidade é obtida, e, finalmente, resulta em uma identificação mais confiante de moléculas. Esta técnica tem sido aplicada ao plasma, lavado bronco-alveolar, e amostras de líquido cefalorraquidiano com volumes tão baixos quanto 50 ul. As amostras podem ser utilizados para várias aplicações, a jusante; por exemplo, o sedimento resultante da precipitação de proteína pode ser armazenada para posterior análise. O sobrenadante do passo que sofre de extracção líquido-líquido usandoágua e solvente orgânico forte para separar os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Uma vez fracionado, a camada hidrofílica pode ser processado para posterior análise ou descartados se não for necessário. A fracção hidrofóbica é ainda tratada com uma série de solventes, durante três passos de extracção em fase sólida para o separam em ácidos gordos, lípidos neutros, e fosfolípidos. Isto permite que o técnico a flexibilidade para escolher qual a classe de compostos é a preferida para análise. Ela também ajuda na identificação metabólito mais confiável, já que existe algum conhecimento da classe química.
As reacções biológicas gerar metabólitos como produtos finais de processos celulares. Metabolomics é uma coleção de todos os compostos presentes no organismo, como resultado desses processos. Ele fornece uma imagem da fisiologia das células e reflete a resposta de um organismo a estímulos externos ou internos 1, 2. Esses estímulos podem ser ambientais, toxicológicos, farmacológicos, dietética, hormonal, ou relacionados à doença. Muitas aplicações metabolômica têm e estão actualmente a ser estudada por pesquisadores e incluem descoberta de biomarcadores 3, estudos de nutrição 4, ciência dos alimentos 5 e testes de drogas 6. Independentemente da aplicação, as variações nos dados, contaminação e presença de falsos positivos têm de ser reduzidas ou, de preferência removido. Na descoberta de biomarcadores ou, no caso de se determinar as diferenças entre um controlo e um grupo de doenças, ou de investigação dos efeitos de drogas em indivíduos, um f biológicaLUID é escolhido com base nas perguntas que estão sendo feitas e os tipos de metabólitos sendo investigado 7. Por exemplo, se a estudar os efeitos imediatos de uma droga inalada nos pulmões de asmáticos, em seguida, explorar metabólitos em lavado broncoalveolar de líquidos (LBA) amostras, antes e após a administração seria preferencial. Para garantir que observadas diferenças são devido à variação biológica real em vez de amostra inadequada técnica de preparação, protocolo laboratorial padronizada e consistente é essencial 8. Informações da amostra deve ser cuidadosamente documentadas para garantir que variáveis como fluido biológico, a estirpe animal, tempo de amostragem, idade sujeito, sexo, só para citar alguns, são todos considerados e tidos em conta no estudo 9. Além disso, para reduzir a possibilidade de contaminação ou de falsos positivos, recomenda-se que os esboços de solventes e espaços em branco do instrumento ser analisado 10.
Para este protocolo, o termo "metabolismolites "será usado para referir-se os compostos identificados reais. Usando o software de fornecedor, um algoritmo inicial pico constatação é usado para detectar picos do espectro de massa. Estes picos estão alinhados com base na massa-para-carga razão (m / z) e tempo de retenção. Um segundo algoritmo é então usado para combinar múltiplas funções num único composto. Isso inclui características tais como sódio, potássio, amónio ou adutos no modo de ionização positivo, e cloreto de no modo de ião negativo. Opções adicionais do software incluem recursos como dímeros e outros adutos. Utilizando a glicose como um exemplo, com picos a 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH4), e 203,05261 m / z (M + Na), haveria três picos correspondentes ao mesmo composto com o primeiro algoritmo. No entanto, quando o segundo algoritmo, que se baseia na fórmula molecular, é aplicada nestes três adutos tornar agrupados em conjunto, resultando em um composto.
Metabólitos podem causar interferências no samples devido à complexidade dos compostos presentes. A presença de milhares de metabólitos em uma amostra causas sinalizar supressão particularmente dos metabólitos menor abundância. Exemplo de limpeza para remover proteínas interferentes, e subsequente separação em várias fracções reduz a complexidade da amostra, melhorando assim a separação de pico, aumentando a resolução, e reduzindo metabolito co-eluição. Portanto, é necessária a limpeza da amostra e uma melhor separação dos compostos. Demonstrou-se que a precipitação da proteína por si só, mesmo com o uso de vários solventes de polaridade, não é possível resolver este problema 11, 12. No entanto, através da combinação de um solvente orgânico forte, tal como o MTBE com um passo de fraccionamento subsequente, a cobertura de metabolito é aumentada. 12 Yang et al. Relataram um aumento nos metabólitos de 1.851 ou 2.073 com metanol ou sozinho precipitação metanol-etanol, respectivamente, para 3.806 metabólitos utilizando MTBE combinado extração por solventeseguido de extracção em fase sólida (SPE) passos. Reduzido sobreposição metabolito, melhor separação de pico e aumento da abundância metabolito foi observada com este método.
Contaminação de não-metabólitos, tais como polímeros, pode ser resultado de coleta de amostras, solventes ou ruído do instrumento, e pode resultar em supressão do sinal de metabólitos potencialmente significativas. Recomenda-se que o técnico (s) e aqueles que recolhem as amostras antes da preparação da amostra usar consistentemente a mesma marca, tipo e tamanho de frascos de coleta de amostras, pontas para pipetas e quaisquer outros tubos utilizados durante a coleta e preparação das amostras. Isso permite que o analista de dados para ter plena confiança de que as mudanças observadas são reais e não devido a diferenças de fundo de outras fontes. Eficácia do tratamento, as variações entre grupos de doenças e controle, ou quaisquer outras análises metabólicas então pode ser investigado com maior confiança.
A metanfetaminaod discutido aqui se concentra na combinação de métodos de preparação de amostras 13-15, que podem ser aplicadas a plasma, LBA, ou amostras para profiling metabolomic não-alvo de espectrometria de cromatografia de massa líquida (LCMS) análise com base no líquido cefalorraquidiano (LCR). Tanto a cromatografia líquida (CL) e cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC) técnicas de separação pode ser acoplado a MS subsequente a este procedimento. Muitos pesquisadores realizando estudos metabolômica usar uma técnica de precipitação de proteínas e / ou uma técnica de extração líquido-líquido 16, 17. Nos nossos estudos, o que resultou em menos metabolitos ser detectado. O método descrito aqui 12 permite a detecção e identificação de um maior número de metabolitos, abrangendo uma vasta gama do metaboloma. Este aumento é devido à maior pureza das amostras e os efeitos da matriz reduzidas provocadas pela separação anterior das classes de metabolitos.
Um prot inicialein passo de precipitação é realizada utilizando-se metanol frio (MeOH) para remover a proteína da amostra. Extracção líquido-líquido (LLE) usando éter metil-terc-butílico (MTBE) e água é usada para separar os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Em seguida, a extracção em fase sólida (SPE), é realizado na camada hidrofóbica para separar os compostos hidrofóbicos em três classes – ácidos gordos, lípidos neutros, e fosfolípidos. As fracções hidrofóbicas são reconstituídos em 100% de metanol, enquanto que a fracção hidrófila é reconstituída em 5% de acetonitrilo em água. A extracção (SPE)-passo em fase sólida proporciona um nível adicional de confiança nos resultados, reduzindo o número de compostos coeluting que seria de outro modo estar presentes tinham um passo de separação não foi realizada.
Um dos objetivos dos estudos clínicos metabolômica é identificar mudanças no metaboloma relacionados com a doença ou tratamentos. Portanto as técnicas de preparação de amostras precisa ser robusto, consistente e transferíveis de técnico para técnico e de laboratório para laboratório 22. Os dados resultantes precisa ser representativa da amostra, e as mudanças identificadas precisam refletir a amostra definida em vez de erros de preparação de amostras. Portanto pipetagem precisa, a temperatura correta, decantação eficiente de camadas imiscíveis, secagem em atmosfera de azoto, e uso das mesmas marcas e tamanhos de copos e dicas são necessárias.
Durante o passo de precipitação de proteína, é fundamental que a mesma quantidade de solução é decantada a partir de cada pelete. Isto reduz a variação de volume e, como tal, reduz a variação nos dados de exemplo. Este passo de precipitação de proteínas é necessária para estudos metabolomic e não pode ser ignorada, uma vez que remove a proteína a partir deas amostras antes da análise de perfil de molécula pequena sobre o espectrómetro de massa. Ele elimina patógenos e grandes macromoléculas, e libera obrigado metabólitos de proteínas 7. A falta de acumulação de proteínas nas amostras aumenta a vida útil da coluna de HPLC e aumenta a precisão e qualidade dos resultados. Figura 5 é uma representação da pelete de proteína formado quando da realização desta técnica em amostras de plasma. Isto permite a detecção de moléculas pequenas, aumenta a abundância de iões, e reduz os efeitos da matriz de proteínas na amostra. Além disso, uma vez que se assume que todas as proteínas são removidos nesta etapa, os aminoácidos que são detectadas durante a análise por LC-MS que originam alterações metabólicas, em vez de a partir de degradação de proteínas.
A fase de extracção líquido-líquido é crítica, uma vez que separa os metabolitos hidrofílicos e hidrofóbicos em duas camadas imiscíveis. Figura 6 mostra o processo LLE e um representantepresentação da camada LLE. Uma separação indevida das duas camadas resulta em metabolitos ou ser perdidos ou sendo eluídas em ambas as fracções. Aplicação cuidadosa deste passo reduz o número de compostos hidrofílicos que aparecem na fracção hidrofóbica. Os resultados para estes compostos tornam-se pouco fiável, uma vez que não pode ser determinado que fracção contém os resultados representativos. Quando feito corretamente, metabólito sobreposição é reduzida.
Para evitar a degradação oxidativa, principalmente em lípidos, mas também, em pequenas moléculas que podem conter grupos tiol, por exemplo, a exposição ao oxigénio tem de ser mantida a um mínimo. Por conseguinte, este procedimento é sempre realizada sob azoto para reduzir / evitar a oxidação dos lípidos ou compostos contendo tiol. Além disso, a transferência da amostra e / ou a solução é rápida (dentro do primeiro minuto), para reduzir a exposição ao oxigénio, em seguida, as amostras são rapidamente colocados sob um fluxo constante de azoto para secar para baixo. Uma vez secos, são imediatamentediatamente ressuspensas em 100% de metanol para as razões acima discutidas.
Laboratórios podem se beneficiar deste método abrangente de várias maneiras; Os pesquisadores procuram isolar uma classe de compostos pode escolher a parte do método que melhor se adapte às suas necessidades. Aqueles que procuram para realizar apenas uma precipitação de proteínas para obter um pool de metabólitos podem fazê-lo. Se os metabolitos hidrofílicos são desejados, tais como muitas drogas farmacêuticas, aminoácidos e açúcares, ou se apenas metabolitos hidrofóbicos são desejados, tais como triglicéridos, epóxidos, vitaminas solúveis em gorduras, e fosfolípidos, por exemplo, em seguida, os investigadores podem realizar a extracção líquido-líquido passo seguinte precipitação de proteínas e descartar a fração indesejada. Os investigadores que necessitam de mais sub-classificação dos compostos hidrofóbicos (lipídios neutros, ácidos graxos e fosfolipídios) podem avançar para a etapa de fracionamento.
Considerações de armazenamento são importantes na maintaining a viabilidade das amostras para análise posterior. Se as amostras são armazenadas de forma incorreta, a degradação ou decomposição pode ocorrer. Idealmente, as amostras devem ser armazenadas em frascos âmbar com tampa de rosca longe de luz para evitar a degradação das espécies sensíveis à luz. As amostras também deve ser mantido congelado a -80 ° C para evitar degradação do metabolito 23-25. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, as amostras são sempre mantidas a 4 ° C no tabuleiro amostrador automático durante a análise por LC-MS. Isto assegura que todas as amostras são mantidas a uma temperatura constante e que as alterações na temperatura ambiente, não afectam a viscosidade, solubilidade, estabilidade ou das amostras. Recomenda-se que os aspectos manuais deste procedimento, como LLE e SPE, ser praticada, a fim de ganhar a confiança e conforto com as etapas envolvidas.
Existem algumas limitações para esta técnica. Discreto separação dos metabólitos hidrofílicos e hidrofóbicos não é garantida como certos compostos vontade inherSuavemente particionar em ambas as frações, devido à sua composição química e taxa de Estado. Além disso, como mostrado na Figura 4, a técnica inadequada durante o passo de extracção do sedimento da proteína pode resultar em fraca reprodutibilidade metabolito em ambas as amostras e os controlos de qualidade. Isso afeta as estatísticas, especialmente em pequenos conjuntos de dados, porque o poder estatístico não está disponível. Portanto, é fundamental que esta etapa ser realizada exatamente no mesmo tempo cada para cada amostra. Outra limitação é o tempo. Embora existam pontos de parada ao longo deste protocolo, onde as amostras podem ser congeladas e a preparação continuou no dia seguinte, um dia inteiro deve ser anulado para realizar esse procedimento. Em terceiro lugar, nem todos os compostos dentro de uma amostra biológica pode ser avaliada para a supressão de iões. Como não é possível identificar como a matriz está afetando cada metabólito individual, a opção é avaliar os padrões internos que teoricamente imitam algumas classes de endogenous metabolitos. Por último, as identificações absolutos não pode ser realizado apenas com este método. Tandem MS em colaboração com pesquisas de banco de dados e padrões são necessários para a identificação absoluta metabólito.
Uma parte importante do metaboloma, é a identificação de compostos. Apesar de não ser discutido em detalhe aqui, as amostras de controle de qualidade foram analisados utilizando LC-MS. Vários espaços de preparação de amostras e espaços em branco instrumento foram preparadas para uso como pano de fundo a subtração de reduzir a taxa de falsos positivos de contaminantes, resultando em visitas metabólitos mais confiáveis. Após esta etapa, o número de "características moleculares" foram agrupados com base em m / z, tempo de retenção, razão isotópica, e adutos para produzir uma lista de compostos reais. Embora a lista de compostos foi grandemente reduzida, os resultados foram mais fiável porque não eram baseados em vários adutos do mesmo composto. O método integral é abrangente e permite isolation de metabolitos hidrofóbicos tais como lípidos neutros, fosfolípidos, ácidos gordos, triglicéridos, e esteróides, enquanto também isolar as classes hidrofílicos na fracção aquosa, dos quais os eicosanóides, açúcares, flavonóides e aminoácidos foram identificados 12, 26.
The authors have nothing to disclose.
O tutorial apresentado foi realizado e desenvolvido no Núcleo Facility Espectrometria de Massas do National Jewish Health. A facilidade NJH MS é apoiado em parte por CCSTI UL1 TR000154. O financiamento de bolsas NIH P20 HL-113445 e R01 HL-095432 também apoiaram este trabalho.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |