האמינות של תוצאות בניסויי metabolomics תלוי באפקטיביות והשחזור של הכנת המדגם. תאר היא שיטה קפדנית ומעמיקה שבמאפשרת מיצוי של מטבוליטים מנוזלים ביולוגיים עם האפשרות של המשך ניתוח עד אלפי תרכובות, או רק את שיעורי המתחם של עניין.
Metabolomics הוא תחום מתפתח אשר מאפשר אפיון של דגימות מיצורי חיים על מנת לקבל תובנות לגבי תהליכים ביולוגיים. היבט חיוני של metabolomics הוא הכנת מדגם לפיו עולות בקנה אחד טכניקות להפיק תוצאות לא אמינות. טכניקה זו כוללת משקעים חלבון, מיצוי נוזל נוזל, ומיצוי מוצק שלב כאמצעי fractionating מטבוליטים לארבע כיתות נפרדות. העשרה משופרת של מולקולות שפע נמוכות עם גידול וכתוצאה מרגישות מתקבלת, וסופו של דבר גורמת לזיהוי בטוח יותר של מולקולות. טכניקה זו הוחל על פלזמה, נוזל שטיפת רונכואלוואולרית, ודגימות נוזל השדרה עם נפחים נמוכים כמו 50 μl. דוגמאות יכולות לשמש ליישומים במורד הזרם מרובים; לדוגמא, את הכדור כתוצאה ממשקעי חלבון יכול להיות מאוחסן לניתוח מאוחר יותר. Supernatant מצעד שעובר מיצוי נוזל נוזל באמצעותמים וממס אורגני חזק כדי להפריד את התרכובות הידרופילי והידרופובי. ברגע שמופרד, שכבת הידרופילי יכולה להיות מעובד לצורך הניתוח מאוחר יותר או שהושלכה אם אין צורך. החלק הידרופובי מטופל נוסף עם סדרה של ממסים בשלושה צעדי חילוץ מוצק שלב כדי להפריד אותו לחומצות שומן, שומנים ניטראליים, ופוספוליפידים. זה מאפשר לטכנאי את הגמישות לבחור איזה סוג של תרכובות עדיפים לניתוח. זה גם מסייע בזיהוי המטבוליט אמין יותר שכן חלק הידע של כיתה כימית קיימת.
תגובות ביולוגיות לייצר מטבוליטים כמוצרים סופיים של תהליכים תאיים. Metabolomics הוא אוסף של כל התרכובות קיימות באורגניזם כתוצאה מתהליכים אלה. הוא מספק תמונה של הפיסיולוגיה של תאים ומשקף תגובה של האורגניזם לגירויים חיצוניים או פנימיים 1, 2. גירויים כאלה יכולים להיות סביבתיים, טוקסיקולוגי, תרופתיים, תזונתיים, הורמונליים, או הקשורים למחלה. יש יישומי metabolomic רבים וכעת הם נחקרים על ידי חוקרים וכוללים סמנים ביולוגיים גילוי 3, לימודי תזונה 4, מדעי מזון 5, ובדיקות סמים 6. ללא תלות ביישום, שינויים בנתונים, זיהום, ונוכחות של תוצאות חיוביות שגויות צריכים להיות מופחתים או רצוי להסירו. בגילוי סמן ביולוגי או במקרה של קביעת הבדלים בין בקרה וקבוצת מחלה, או לחקור השפעות של תרופות על נושאים, ו ביולוגיluid נבחר מבוססת על השאלות שהוא שאל והסוגים של מטבוליטים נחקרים 7. לדוגמא, אם לומד את ההשפעות מיידיות של תרופה בשאיפה על הריאות של חולי אסתמה, ולאחר מכן לבחון מטבוליטים בנוזל שטיפה ברונכואלוואולרית (בלף) דגימות לפני ואחרי הנטילה יהיה מועדף. כדי להבטיח שנצפה הבדלים הם עקב וריאציה ביולוגית בפועל ולא מדגם טכניקת הכנה לא תקינה, פרוטוקול מעבדה סטנדרטי ועקבי הוא חיוני 8. מידע מדגם חייב להיות מתועד בקפידה כדי להבטיח שמשתנים כגון נוזל ביולוגי, זן בעלי חיים, זמן דגימה, גיל נושא, מין, עד כמה שם, כולם נחשבים ונלקח בחשבון במחקר 9. בנוסף, כדי לצמצם את האפשרות של זיהום או חיובי שגוי, מומלץ שחסר ממס ואת החסר מכשיר להיות מנותח 10.
עבור פרוטוקול זה, METABO המונח "לייט "ישמש להתייחס לתרכובות בפועל מזוהות. באמצעות ספק תוכנה, אלגוריתם ממצא שיא ראשוני משמש כדי לזהות פסגות רפאים המוניות. פסגות אלה מיושרים המבוססים על יחס בין מסה למטען (m / z) ושמירת זמן. אלגוריתם שני לאחר מכן נעשה שימוש כדי לשלב תכונות מרובות לתוך מתחם אחד. זה כולל תכונות כגון נתרן, אשלגן, או adducts אמוניום במצב היינון החיובי, וכלוריד במצב היונים השלילי. אפשרויות נוספות בתוכנה כוללות תכונות כגון הדימרים וadducts אחרים. שימוש בגלוקוז כדוגמא, עם פסגות ב181.0707 מ '/ z (M + H), 198.0972 מ' / z (M + NH 4), ו203.05261 מ '/ z (M + Na), יהיו שלוש פסגות המתאימות לאותו מתחם באמצעות האלגוריתם הראשון. עם זאת, כאשר האלגוריתם השני, המבוסס על נוסחה מולקולרית, מוחל שלושה adducts אלה הופך מקובצים יחד וכתוצאה ממתחם אחד.
מטבוליטים יכולים לגרום להפרעות בsamples בשל המורכבות של תרכובות הווה. נוכחותם של אלפי מטבוליטים בגורמי דגימה אחת לאותת דיכוי במיוחד של מטבוליטים שפע נמוכים יותר. ניקוי מדגם להסיר מפריע חלבונים, וההפרדה הבאה לשברים מרובים מפחיתה את המורכבות של המדגם ובכך לשפר את הפרדת שיא, הגדלת רזולוציה, והפחתת Coelution המטבוליט. לכן, נדרשים ניקוי מדגם משופר והפרדה של תרכובות. הוכח כי משקעים חלבון לבד, אפילו עם השימוש בממסים קוטבי שונים, לא יכול לפתור בעיה זו 11, 12. עם זאת, על ידי שילוב של ממס אורגני חזק כגון MTBE בצעד חלוקה שלאחר מכן, כיסוי המטבוליט הוא גדל. יאנג et al. 12 דיווחו על עלייה במטבוליטים מ1,851 או 2,073 עם מתנול או ממטרים מתנול אתנול בלבד בהתאמה, ל3,806 מטבוליטים באמצעות מיצוי בממסים MTBE בשילובאחרי מיצוי מוצק שלב צעדים (SPE). חפיפה מופחתת המטבוליט, הפרדת שיא משופרת ושפע המטבוליט מוגבר נצפו עם שיטה זו.
זיהום מהלא מטבוליטים, כגון פולימרים, יכול לנבוע מאיסוף דגימה, ממסים, או רעש של מכשיר, והוא יכול לגרום לדיכוי אות של מטבוליטים שעלולים להיות משמעותיים. מומלץ כי הטכנאי (ים) ומי לאסוף את הדגימות לפני לדגום הכנה באופן עקבי להשתמש באותו מותג, סוג וגודל בקבוקוני איסוף דגימה, הטיפים פיפטה וכל צינורות אחרים המשמשים במהלך האיסוף וההכנה של הדגימות. זה מאפשר לאנליסט נתונים יש ביטחון מלא שהשינויים שנצפו הם אמיתיים ולא בשל הבדלי רקע ממקורות אחרים. יעילות טיפול, הבדלים בין קבוצות מחלה ובקרה, או כל ניתוחים מטבוליים אחרים אז יכולים להיות שנחקרו בביטחון מוגבר.
ספידOD דן כאן מתמקד בשיטות משולבות מדגם הכנת 13-15 אשר יכול להיות מיושמות על פלזמה, בלף, או נוזל המוח והשדרה (CSF) דגימות לפרופיל metabolomic הלא ממוקד לספקטרומטריית נוזל כרומטוגרפיה מסה (LCMS) ניתוח מבוסס. שתי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) וכרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) יכולה להיות בשילוב טכניקות הפרדה לטרשת נפוצה לאחר הליך זה. חוקרים רבים מבצעים מחקרי metabolomic להשתמש גם בטכניקת משקעים חלבון ו / או טכניקת נוזל נוזל מיצוי 16, 17. במחקרים שלנו, כל זה הסתיים בפחות מטבוליטים שיראו. השיטה המתוארת כאן 12 מאפשרת איתור וזיהוי של מספר גדול יותר של מטבוליטים, המשתרע על מגוון רחב יותר של metabolome. גידול זה נובע מהטוהר גבוה יותר של הדגימות ואפקטי מטריצה מופחתות שנגרמו על ידי הפרדה מראש של שיעורי המטבוליט.
Prot ראשוניצעד ממטרים עין מתבצע באמצעות מתנול הקר (MeOH) כדי להסיר חלבון מן המדגם. מיצוי נוזל נוזל (איל) באמצעות אתר מתיל טרט בוטיל (MTBE) ומים משמש להפרדת התרכובות הידרופילי והידרופובי. ואז מיצוי מוצק שלב (SPE) מבוצע על השכבה הידרופובי להפריד את התרכובות הידרופובי לשלושה סוגים – חומצות שומן, שומנים ניטראליים, ופוספוליפידים. שברים הידרופובי מחדש במתנול 100%, ואילו חלק קטן הידרופילי הוא מחדש באצטוניטריל 5% במים. הצעד מוצק שלב חילוץ (SPE) מספק רמה נוספת של ביטחון בתוצאות על ידי צמצום מספר תרכובות coeluting אשר אחרת היה להיות נוכחים הייתה צעד הפרדה לא בוצע.
אחת ממטרות מחקרי metabolomic הקליניים היא לזהות שינויים בmetabolome הקשורים למחלה או טיפולים. לכן טכניקות הכנת מדגם צריכים להיות חזק, עקבי וניתנים להעברה מטכנאי לטכנאי וממעבדה למעבדה 22. את הנתונים המתקבלים צריך להיות נציג של המדגם, ושינויים שזוהו צריכים לשקף את המדגם שנקבע ולא שגיאות הכנת מדגם. לכן pipetting מדויק, טמפרטורה נכונה, decanting יעיל של שכבות immiscible, ייבוש תחת חנקן, ושימוש באותו המותגים וגדלים של כלי זכוכית וטיפים נחוצים.
במהלך שלב המשקעים חלבון, זה קריטי, כי את אותה הכמות של פתרון יצקה מכל גלולה. הפעולה זו מפחיתה את השונות בעוצמת קול ובתור שכזו מפחיתה את השונות בנתונים לדוגמה. צעד משקעים חלבון זה הוא הכרחי ללימודי metabolomic ולא ניתן לדלג שכן הוא מסיר את החלבון מןהדגימות לפני המולקולה קטנה פרופיל ניתוח על ספקטרומטר המסה. זה מבטל פתוגנים ומקרומולקולות גדולות, ומשחרר מחויבים מטבוליטים מחלבונים 7. חוסר הצטברות חלבון בדגימות מרחיב את החיים עמודת HPLC ומגביר את הדיוק ואת איכות תוצאות. איור 5 הוא תיאור של גלולה החלבון שנוצרה בעת ביצוע טכניקה זו על דגימות פלזמה. זה מאפשר זיהוי של המולקולות קטנות, משפר שפע יון, ומפחית את השפעות מטריצה מחלבונים במדגם. בנוסף, מאחר שהנחה הוא שכל החלבונים מוסרים בשלב זה, חומצות אמינו, המתגלים במהלך ניתוח LC-MS יהיו מקורן שינויים מטבוליים ולא מפירוק חלבון.
שלב חילוץ נוזל הנוזל הוא קריטי שכן הוא מפריד בין מטבוליטים הידרופילי ו הידרופובי לשתי שכבות immiscible. איור 6 מציג את הליך האיל ונציגresentation של שכבת האיל. הפרדה לא תקינה של שתי שכבות התוצאה מטבוליטים או ללכת לאיבוד או להיות eluted בשני השברים. יישום זהיר של צעד זה מפחית את מספר התרכובות הידרופיליות המופיעות בחלק הידרופובי. התוצאות עבור התרכובות אלה הופכים בלתי אמינות שכן הוא לא ניתן לקבוע שחלק מכיל את תוצאות הנציג. כאשר נעשה בצורה נכונה, חפיפה המטבוליט מצטמצמת.
כדי למנוע השפלה חמצוני, במיוחד בשומנים, אלא גם במולקולות קטנות שיכול להכיל קבוצות תיאול לדוגמא, חשיפה לחמצן צריכה להישמר עד למינימום. לפיכך, הליך זה תמיד מבוצע תחת חנקן להפחתה / מניעת חמצון של שומנים בדם או תרכובות המכילה תיאול. בנוסף, העברת המדגם ו / או הפתרון היא מהירה (בדקה הראשונה) כדי להפחית את החשיפה לחמצן, ולאחר מכן דגימות מונחות תחת זרם יציב של חנקן במהירות להתייבש למטה. יבש פעם אחת, הם היא מידresuspended ately במתנול 100% מהסיבות שפורטו לעיל.
מעבדות יכולות להפיק תועלת משיטה מקיפה זו במספר הדרכים; חוקרים מחפשים לבודד סוג אחד של תרכובות יכולים לבחור חלק מהשיטה שמתאימה ביותר לצרכיהם. אלה המבקשים לבצע משקעים חלבון רק כדי להשיג בריכה של מטבוליטים יכולים לעשות כן. אם מטבוליטים הידרופילי הם רצויים, כגון תרופות רבות תרופות, חומצות אמינו, וסוכרים, או אם רק מטבוליטים הידרופובי הם רצויים, כגון טריגליצרידים, אפוקסים, ויטמינים מסיסים בשומן, פוספוליפידים ולמשל, אז חוקרים יכולים לבצע שאיבת נוזל הנוזל הצעד הבא משקעים חלבון וזורקים את החלק רצוי. חוקרים שדורשים סיווג משנה נוסף של התרכובות הידרופוביות (שומנים ניטראליים, חומצות שומן, פוספוליפידים ו) יכולים להמשיך לשלב חלוקה.
שיקולי חפצים חשובים בmaintaining את הכדאיות של דגימות לצורך הניתוח מאוחר יותר. אם דגימות מאוחסנות בצורה לא נכונה, השפלה או פירוק יכולה להתרחש. באופן אידיאלי, יש לאחסן דגימות בבקבוקוני ענבר כובע בורג במרחק של אור כדי למנוע השפלה של מינים רגישים לאור. צריכים גם להישמר דגימות קפואות ב -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה המטבוליט 23-25. למרות שלא נידונו בפירוט כאן, דגימות נשמרות תמיד על 4 מעלות צלזיוס במגש autosampler במהלך ניתוח LC-MS. הדבר מבטיח כי כל הדגימות נשמרות בטמפרטורה קבועה, וכי שינויים בטמפרטורת הסביבה אינו משפיעים על הצמיגות, מסיסות, או היציבות של הדגימות. מומלץ כי ההיבטים ידניים של הליך זה, כגון איל וSPE, להיות מתורגל כדי לרכוש את אמונו ונוחות עם הצעדים מעורבים.
כמה מגבלות קיימות לטכניקה זו. הפרדה דיסקרטית של מטבוליטים הידרופובי והידרופילי אינה מובטחת כמו תרכובות מסוימות inher תהיהently לחלק לשני השברים בשל מצב ההרכב כימי ותשלום שלהם. בנוסף, כפי שמוצג באיור 4, טכניקה פסולה בשלב חילוץ גלולה חלבון יכול לגרום לשחזור המטבוליט עניים בשתי הדגימות ובקרת איכות. זה משפיע על הסטטיסטיקה, במיוחד במערכי נתונים קטנים בגלל הכוח הסטטיסטי אינו זמין. לכן זה קריטי, כי צעד זה יבוצע בדיוק באותו הזמן בכל עבור כל דגימה. מגבלה נוספת היא זמן. למרות שיש נקודות עצירה לאורך כל הפרוטוקול הזה שבו אפשר להקפיא דגימות וההכנה המשיכה ביום שלמחרת, יש לקבוע יום שלם הצידה כדי לבצע הליך זה. שלישית, לא כל מתחם בתוך מדגם ביולוגי ניתן להעריך לדיכוי יון. מאחר שלא ניתן לזהות כיצד המטריצה משפיעה על כל המטבוליט בודד, האפשרות הנוכחית היא להעריך את הסטנדרטים הפנימיים אשר באופן תיאורטי לחקות כמה סוגים של endogenouמטבוליטים של. לבסוף, לא ניתן לבצע זיהוי מוחלט אך ורק בשיטה זו. טנדם MS בשיתוף עם חיפושים במאגר נתונים ותקנים הנדרשים לזיהוי המטבוליט מוחלט.
חלק חשוב של metabolomics הוא זיהוי של תרכובות. למרות שלא נידון בפירוט כאן, דגימות בקרת האיכות נותחו באמצעות LC-MS. כדורי סרק מרובים מדגם הכנה ואת החסר מכשיר הוכנו לשימוש כרקע חיסור כדי להפחית את השיעור של תוצאות חיוביות שגויות ממזהמים, ובכך וכתוצאה מלהיטי המטבוליט אמינים יותר. בעקבות צעד זה, מספר "תכונות מולקולריות" קובצו יחד על בסיס מ '/ z, זמן שמירה, יחס איזוטופ, וadducts לייצר רשימה של תרכובות בפועל. למרות שהרשימה של תרכובות הייתה פחותה בהרבה, התוצאות היו אמינות יותר כפי שהם אינם מבוססים על adducts מרובה מאותו המתחם. השיטה המלאה היא מקיפה ומאפשרת isolation של מטבוליטים הידרופובי כגון שומנים ניטראליים, פוספוליפידים, חומצות שומן, טריגליצרידים, וסטרואידים, אך גם בידוד כיתות הידרופילי בחלק המימית, מתוכם eicosanoids, סוכרים, פלבנואידים, וחומצות אמינו זוהו 12, 26.
The authors have nothing to disclose.
ההדרכה שהוצגה בוצעה ופותחה בתוך מתקן Core ספקטרומטריית המסה בבית הלאומי יהודית הבריאות. מתקן NJH MS נתמך בחלקו על ידי CCSTI UL1 TR000154. מימון ממענקי NIH P20 HL-113445 וR01 HL-095,432 נתמכים גם על עבודה זו.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |