High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie
Summary
Der Artikel beschreibt die detaillierte Methode zur menschlichen pluripotenten Stammzellen differenzieren zu Herzmuskelzellen wirksam durch selektives Modulieren des Wnt-Signalwegs, gefolgt von Durchflusszytometrie-Analyse von Referenzmarkierungen, um die Homogenität und Identität der Population abzuschätzen.
Abstract
Es ist dringend notwendig, um Ansätze für die Reparatur der geschädigten Herz, die Entdeckung neuer therapeutischer Medikamente, die nicht über toxische Wirkungen auf das Herz, und die Verbesserung der Strategien, um genau zu modellieren Herzkrankheit zu entwickeln. Das Potenzial der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Technik zur Nutzung zu Herzmuskel "in einer Schale" für diese Anwendungen zu generieren weiterhin hohe Begeisterung zu erzeugen. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) effizient zu erzeugen stark verbessert, bietet uns neue Möglichkeiten sehr frühen Stadien der menschlichen Herzentwicklung modelliert nicht zugänglich. Im Gegensatz zu vielen früheren Verfahren, die hier beschrieben Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll keine Zellaggregation oder die Zugabe von Activin A oder BMP4 erfordern und robust erzeugt Kulturen von Zellen, die stark positiv für Herz-Troponin I und T (TNNI3, TNNT2) iroquois- Klasse homeodomain ProteinIRX-4 (IRX4), Myosin regulatorische leichte Kette 2, ventrikuläre / Herzmuskel-Isoform (MLC2v) und Myosin regulatorische leichte Kette 2, Vorhof Isoform (MLC2a) am Tag 10 in allen menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) und hiPSC Linien getestet Datum. Zellen können agiert und für mehr als 90 Tage in Kultur gehalten werden. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren und kostengünstig. Charakterisierung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Zellen abgeleitet sind oft die Analyse von Referenz-Markierungen sowohl auf der mRNA-und Proteinebene. Zur Proteinanalyse, Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges analytisches Werkzeug für die Beurteilung der Qualität der Zellen in Kultur und Bestimmen Subpopulation Homogenität. Allerdings können technische Variation in der Probenvorbereitung erheblich beeinträchtigen die Qualität der Durchflusszytometrie Daten. So sollte die Standardisierung von Färbeprotokollen Vergleiche zwischen verschiedenen Differenzierungsstrategien erleichtern. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 und TNNT2 durch Durchflusszytometrie beschrieben.
Introduction
Die Erzeugung von Kardiomyozyten aus hPSCs, einschließlich hESC und hiPSC, kann als ein in vitro-Modell der sehr frühen menschlichen Entwicklungsprozesse Herz funktionieren, die einen Einblick in Stadien nicht anders für mechanistische Studien zugänglich. Dieses Modellsystem bietet einzigartige Möglichkeiten, um die molekularen Signalwege, die Herzlinie Engagement und das Schicksal der Zelle steuern Spezifikation zu studieren. In den letzten Jahren hat die Fähigkeit, kardiomyogenen Zellen effizient zu erzeugen aus hPSCs stark verbessert 1-15. Jedoch unter Protokolle gibt es Zellinie Variation in Bezug auf den Wirkungsgrad bei der Erzeugung von Herzmuskel Zellen und Zeitpunkt, zu dem die Zellen exprimieren Kammer spezifische Marker (zB Ventrikel und Vorhof). Idealerweise sollte für zukünftige Anwendungen dieses Modellsystems, homogener Populationen von Zellen funktionell definiert sind erwünscht. Im Gegensatz zu bisherigen Methoden, die hier beschriebene Kardiomyozytendifferenzierung Protokoll nicht ce erfordernll Aggregation oder die Zugabe von Activin A oder Bone morphogenetic protein 4 (BMP4) und robust erzeugt Kulturen sehr positiv für TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v und MLC2a Tag 10 Zellen in allen bisher getesteten humanen embryonalen Stammzellen und hiPSC Linien. Die Strategie ist technisch einfach zu realisieren, insbesondere im Vergleich zu dreidimensionalen Kulturen Massenkultur oder Embryoidkörperbildung basierte Strategien 4-9 und wurde vor kurzem in einer Studie, die ein kleines Molekül mit selektiver Toxizität gegen hPSCs beschreibt (Boheler et al. ) 65. Merkmale dieses Protokoll enthalten Differenzierung hPSCs in Monolayer-Kultur mit einer einzigen Schicht einer hESC qualifizierte Matrix (Matrigel), vollständig definierten Medien mit kleinen Molekülen, um Wnt-Signal (ähnlich, aber unterscheidet sich von 1,2,7,13) modulieren, und optimiert Durchflusszytometrie Färbemethoden für die Bewertung der Effizienz und Differenzierung Zellidentität. Zusammenfassend Vorteile dieses Protokoll im Vergleich zu früheren Berichten sind die Kosten-Wirksamfreundlicher Genehmigung von Eness, Reproduzierbarkeit und der hohen Effizienz für die Erzeugung Kardiomyozyten unter mehreren HPSC Linien, einschließlich hESC und hiPSC Linien.
Durchflusszytometrie ist ein leistungsstarkes Analyse-Tool zur Bewertung der Qualität von Zellen in Kultur und Bestimmung Subpopulation Homogenität, und mit der richtigen experimentellen Design, können quantitative Messungen liefern. Wie bei allen Antikörpern basierenden Strategien genaue Interpretation der experimentellen Ergebnisse, müssen Teile des Assaydesign einschließlich Antikörperkonzentration und der Fixierung und Permeabilisierung Bedingungen (bei intrazelluläre Targeting-Antigene) werden sorgfältig für jeden Antikörper getestet suboptimalen Bedingungen Leistungsfähigkeit der Antikörper signifikant beeinflussen Bindung und daher die Interpretation der Ergebnisse. Wichtiger ist, wenn die Quantifizierung erforderlich ist, sind monoklonale Antikörper wesentlich, da polyklonale Antikörper können mehrere Epitope erkennen, und sind anfällig für Batch-to-Batch-Variante. Derzeit ist eine Vielzahl von Antikörpern (polyclonal und monoklonal) und Färbungsprotokolle sind für die Bewertung der in vitro Differenzierung beschrieben worden ist, macht es schwierig, die Effizienz der Kardiomyogenese unter 1,2,9,11-Protokolle zu vergleichen. Aus diesem Grund werden monoklonale Antikörper verwendet, wenn verfügbar für alle Durchflusszytometrie analysiert. In Zukunft ist zu erwarten, dass die Standardisierung dieser Färbeprotokollen, insbesondere im Hinblick auf die Quantifizierung, sollte besser zu ermöglichen Vergleich unter Differenzierungsstrategien.
Die Wahl der Marker und ihre entsprechenden Antikörper, verwendet, um die Reinheit des in vitro Kardiomyogenese beurteilen variiert unter Berichte. TNNT2 wurde als Indikator für die Zellen an der Herzmuskel Schicksal gebunden und wird routinemäßig verwendet, um die Effizienz der Herzdifferenzierungsprotokollen zu bewerten. Allerdings TNNT2 wird auch in der Skelettmuskulatur während der frühen Entwicklung Küken und Ratten 16,17 ausgedrückt und in humanen glatten Muskelzellen 18 vorhanden ist </sup>. Somit ist TNNT2 nicht notwendigerweise eine spezifische Markierung des menschlichen Kardiomyogenese in vitro. MLC2v und MLC2a routinemäßig als Surrogatmarker der ventrikulären und atrialen Subtypen verwendet wurden. Herausforderungen mit sich auf MLC2v und MLC2a zu Kardiomyozyten Subtyp im Zusammenhang mit der in vitro Differenzierung bestimmen ergeben sich jedoch aus der Tatsache, dass diese Genprodukte nicht auf einen bestimmten Herzkammer während der Entwicklung durch Erwachsenen beschränken, Herzrohr. In das Nagetier geschleift Herz, MLC2a mRNA vorherrschende in den Trakt Bereich Vorhof / Zufluss und MLC2v mRNA überwiegt in den ventrikulären / Ausflusstrakt Regionen. In der geloopten Herzen, sind Co-Expression von MLC2a und MLC2v mRNAs in den Einflusstrakt, AV-Kanal, und der Ausflusstrakt 19,20 beobachtet. Von 3 Tagen nach der Geburt wird MLC2v mRNA an den Ventrikel eingeschränkt und 10 Tage nach der Geburt wird MLC2a an die Vorhöfe des neonatalen Rattenherz 19 beschränkt. Daher InterpretationDaten hinsichtlich Kardiomyogenese Effizienz und Subtyp Identität nicht nur prüfen, das Vorhandensein und die Menge der Referenzmarker Ebenen, sondern muss die Entwicklungsphase (n), für die die Zeitpunkte der Differenzierung, die analysiert werden, entsprechen berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig, wenn man, dass die Phase der Reifung kardiomyogenen Zellen durch in vitro Differenzierung von hPSCs erzeugt ähnelt am ehesten denen von embryonalen / fetalen Entwicklung 21-25. So, die sich auf räumliche Expression eines Markers in der postnatalen Herz kann nicht für die Beurteilung der HPSC-abgeleiteten Zellen, zumindest in einigen Fällen sinnvoll sein.
In dem Bemühen um die Entwicklung spezifischer Kriterien zur Definition Kardiomyozyten Identität in vitro zu erleichtern, wird TNNI3 als ein wertvoller Marker zur Bewertung Kardiomyogenese in vitro, wie sie zum Herzmuskel gesamten Embryogenese bei Küken und Zebrafisch 15,20 beschränkt seinund ist in der menschlichen fetalen Skelettmuskel 26 fehlen. Während TNNI1 in der menschlichen fetalen Herzens vorhanden ist, ist TNNI3 in normalen erwachsenen Herzen 27,28 die einzige Isoform TNNI vorhanden. In Bezug auf Kardiomyozyten Subtyp Identität, IRX4 29-31 ist eine informative Marker von Zellen mit einer ventrikulären Schicksal. Auf der Proteinebene wurde IRX4 kürzlich gezeigt, an den Ventrikel von linearen Herzrohres durch neonatale Stufen der Maus 32 beschränkt werden. Dementsprechend optimiert Färbeprotokollen zur Analyse TNNI3 und IRX4 durch Durchflusszytometrie beschrieben. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Beschreibung eines Verfahrens zur effizienten Antikörper-basierte Färbung und Analyse IRX4 in Human Kardiomyozyten durch Durchflusszytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritisch für den Erfolg der Differenzierungsprotokoll ist die Verwendung von hochwertigen Kulturen hPSCs das auf Einzelzellebene für mindestens fünf Passagen vor Beginn der Differenzierung agiert wurden. Ähnliche Differenzierung Effizienzen werden routinemäßig unter verschiedenen HPSC Linien beobachtet, wenn sie 100% konfluent zu Beginn der Differenzierung, unabhängig von Zelllinie. Suboptimalen Leistungsfähigkeit beobachtet, wenn die Konfluenz der Zellen zu Beginn der Differenzierung ≤95% oder> 100%. Daher…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die NIH 4R00HL094708-03 unterstützt, MCW Forschungsausschuss New Faculty Award, und der Kern-Stiftung (Startfonds) an der Medizinischen Hochschule von Wisconsin (RLG); Research Grants Council of Hong Kong Theme-Based Research Scheme T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394 und AHA Gegründet Investigator Award (JCW); AHA Postdoctoral Fellowship 12POST12050254 (PWB). Wir danken Hoffnung Campbell an der Durchflusszytometrie Kern des Blut Research Institute of Wisconsin für die Unterstützung bei der Datenerhebung und die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
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