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生物学

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Published: September 23, 2014
doi:
10.3791/52010
, , , , , , ,
1Department of Biochemistry,Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute,Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology,Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine,Hong Kong University, 5Division of Cardiology,Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center,Medical College of Wisconsin

Summary

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Abstract

Há uma necessidade urgente de desenvolver abordagens para reparar o coração danificado, descobrir novas drogas terapêuticas que não têm efeitos tóxicos no coração, e melhorar as estratégias de modelar com precisão a doença cardíaca. O potencial de exploração da tecnologia humana célula-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) para gerar músculo cardíaco "em um prato" para estas aplicações continua a gerar grande entusiasmo. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem melhorado muito, nos oferecendo novas oportunidades para modelar estágios muito iniciais de desenvolvimento cardíaco humano não acessíveis de outra forma. Em contraste com muitos métodos anteriores, o protocolo de diferenciação de cardiomiócitos aqui descrito não requer a agregação de células, ou a adição de Activina A ou BMP4 e robustamente gera culturas de células que são altamente positivo para a troponina I cardíaca e T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína classe homeodomínioIRX-4 (IRX4), miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma muscular ventricular / cardíaco (MLC2v) e miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma atrial (MLC2a) por 10 dias em todas células estaminais embrionárias humanas (hESC) e linhas hiPSC testado para data. As células podem ser passadas e mantida por mais de 90 dias em cultura. A estratégia é tecnicamente simples de implementar e de baixo custo. Caracterização de cardiomiócitos derivados de células pluripotentes inclui muitas vezes a análise de marcadores de referência, tanto ao nível do mRNA e de proteínas. Para a análise de proteínas, a citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células na cultura e a determinação subpopulação homogeneidade. No entanto, a variação técnica na preparação da amostra pode afetar significativamente a qualidade de citometria de fluxo de dados. Assim, a padronização de protocolos de coloração deve facilitar as comparações entre as várias estratégias de diferenciação. Deste modo, optimizado para protocolos de coloração para a análise de IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 por citometria de fluxo encontram-se descritos.

Introduction

A geração de cardiomiócitos de hPSCs, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC, pode funcionar como um modelo in vitro de processos de desenvolvimento cardíacos humanos muito antigos, fornecendo informações sobre as fases de outra forma não acessíveis para estudos mecanicistas. Este modelo de sistema fornece uma oportunidade única para estudar as vias moleculares que controlam o compromisso linhagem cardíaca e especificação destino celular. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica de hPSCs tem melhorado muito 1-15. No entanto, entre os protocolos há uma variação de linha de células no que respeita à eficiência na geração de células cardiomiogênica e tempo em que as células expressam marcadores específicos de câmara (por exemplo, átrios e ventrículo). Idealmente, para aplicações futuras deste sistema modelo, as populações mais homogêneas de células funcionalmente definidos são desejados. Em contraste com os métodos anteriores, a diferenciação de cardiomiócitos protocolo aqui descrito não necessita cell agregação ou a adição de Activin A ou proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) e robusta gera culturas altamente positivo para TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v e MLC2a por dia 10 células em todas as linhas hESC e hiPSC testadas até o momento. A estratégia é tecnicamente simples de implementar, especialmente em comparação com culturas tridimensionais, cultura de massa, ou estratégias baseadas corpo embrióide 4-9, e recentemente foi definido em um estudo que descreve uma pequena molécula com toxicidade seletiva para hPSCs (Boheler et al. ) 65. Características deste protocolo incluem a diferenciação hPSCs em cultura em monocamada, utilizando uma única camada de uma matriz qualificado hESC (Matrigel), meios totalmente definidos, utilizando pequenas moléculas para modular a sinalização Wnt (similar, mas distinto do 1,2,7,13), e fluxo optimizado citometria de métodos de coloração para avaliação da eficiência da diferenciação e da identidade da célula. Em resumo, as vantagens deste protocolo em relação a relatórios anteriores incluem o seu custo-effectiveness, reprodutibilidade e sua alta eficiência para a geração de cardiomiócitos entre várias linhas HPSC, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC linhas.

A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células em cultura e determinação subpopulação homogeneidade e com design experimental adequada, pode fornecer medições quantitativas. Tal como acontece com todas as estratégias baseadas em anticorpos, a interpretação precisa dos resultados experimentais exige que os elementos do desenho do ensaio, incluindo concentração de anticorpos e fixação e condições de permeabilização (quando segmentação antígenos intracelulares) são cuidadosamente testados para cada anticorpo como condições sub-ótimas afetar significativamente a eficiência de anticorpo ligação, e portanto, a interpretação dos resultados. É importante notar que se a quantificação é necessária, os anticorpos monoclonais são essenciais, tal como anticorpos policlonais podem reconhecer epitopos múltiplos e são propensos a variação de lote para lote. Actualmente, uma variedade de anticorpos (poprotocolos lyclonal e monoclonais) e de coloração têm sido descritos para a avaliação da diferenciação in vitro, o que torna difícil comparar a eficiência de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por essa razão, os anticorpos monoclonais são utilizados quando disponíveis para todas as análises de citometria de fluxo. Para o futuro, espera-se que a padronização destes protocolos de coloração, especialmente com relação à quantificação, deve permitir uma melhor comparação entre estratégias de diferenciação.

A escolha dos marcadores, e os seus anticorpos correspondentes, utilizados para avaliar a pureza de cardiomyogenesis in vitro varia entre os relatórios. TNNT2 tem sido considerado um indicador das células comprometidas com o destino cardiomiogênica e é rotineiramente utilizado para avaliar a eficiência de protocolos de diferenciação cardíacos. No entanto, também é TNNT2 expresso no músculo esquelético durante o início de pinto de rato e o desenvolvimento 16,17 e está presente no músculo liso humano 18 </sup>. Assim, TNNT2 não é, necessariamente, um marcador específico de cardiomyogenesis humana in vitro. MLC2v e MLC2a são rotineiramente utilizados como marcadores substitutos de subtipos ventriculares e atriais, respectivamente. No entanto, os desafios com contando com MLC2v e MLC2a para determinar o subtipo de cardiomiócitos no contexto de diferenciação in vitro surgem do fato de que estes produtos de genes não pode ser restrito a uma câmara específica ao longo do desenvolvimento cardíaco, tubo de coração através de um adulto. No roedor loop coração, MLC2a mRNA é predominante na zona do átrio / entrada trato e MLC2v mRNA é predominante nas regiões do trato ventricular / descarga. No coração loop, co-expressão de MLC2a e MLC2v mRNAs são observados na via de entrada, canal atrioventricular, e via de saída 19,20. Aos 3 dias após o nascimento, MLC2v mRNA é restrito para o ventrículo e, aos 10 dias após o nascimento, MLC2a é restrita às aurículas do coração de rato neonatal 19. Portanto, a interpretaçãode dados sobre a eficiência cardiomyogenesis e subtipo identidade não só deve considerar a presença ea quantidade de níveis de marcadores de referência, mas deve considerar o estágio (s) de desenvolvimento a que os instantes de diferenciação que são analisados ​​correspondem. Isto é especialmente importante considerando-se que a fase de maturação das células cardiomiogênica gerados pela diferenciação in vitro de hPSCs mais se assemelha aqueles do desenvolvimento embrionário / fetal 21-25. Assim, com base na expressão espacial de um marcador no coração pós-natal pode não ser apropriado para a avaliação de células HPSC derivados, pelo menos em alguns casos.

Em um esforço para facilitar o desenvolvimento de critérios mais específicos para a definição da identidade de cardiomiócitos in vitro, TNNI3 é considerada um marcador importante na avaliação de cardiomyogenesis in vitro, uma vez que é restrito no músculo cardíaco durante toda a embriogênese em garota e peixe-zebra 15,20e está ausente no músculo esquelético humano fetal 26. Enquanto TNNI1 está presente no coração fetal humano, TNNI3 é a única isoforma presente TNNI no coração adulto normal 27,28. Quanto cardiomiócitos subtipo identidade, IRX4 29-31 é um marcador informativo de células com um destino ventricular. Ao nível da proteína, IRX4 foi recentemente mostrado para ser restringida ao ventrículo do coração do tubo linear através de estágios neonatais do rato 32. Por conseguinte, os protocolos de coloração optimizados para a análise de TNNI3 IRX4 e por citometria de fluxo encontram-se descritos. Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de um método para a coloração com anticorpos e análise eficiente dos níveis IRX4 em cardiomiócitos humanos, por citometria de fluxo.

Protocol

1. Solution e preparação da mídia hESC Matrix Qualificado revestimento da Solução Lentamente descongelar hESC matriz qualificado (5 ml) em gelo, a 4 ° C durante a noite. Dispense alíquotas em microtubos pré-refrigerados, 1,5 ml estéril e armazenar imediatamente a -20 ° C. NOTA: O volume da alíquota vai variar com base no lote e varia tipicamente 270-350 ul. Fabricante fornece detalhes sobre o volume de alíquota necessária para alcançar uma concentração 1x por diluição em 25 m…

Representative Results

No dia 0, as células são 100% confluentes com morfologia compacta e os detritos celulares mínima. Nos dias 1-2, é comum observar-se morte celular significativa (40-50%), mas as células anexadas reterá morfologia compacto (Figura 1A). Durante este tempo, a mídia é laranja e turva. Meios-de-rosa indica morte excessiva de células, e, neste caso, confirmar com azul de tripan e interromper se a morte celular superior a 70%. As células irão recuperar durante 3-4 dias e vai aumentar a densidade. Dur…

Discussion

Crítico para o sucesso do protocolo de diferenciação é a utilização de culturas de elevada qualidade de hPSCs que foram passadas a nível da célula individual durante pelo menos cinco passagens antes do início da diferenciação. Diferenciação eficiências semelhantes são habitualmente observado entre as várias linhas de HPSC se forem 100% confluentes no início da diferenciação, independente da linha de células. Eficácia subóptima é observado se a confluência de células no início de diferenciação…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi financiado pelo NIH 4R00HL094708-03, Assuntos MCW Pesquisa Comitê Nova Faculdade Award, ea fundação Kern (fundos de inicialização) no Medical College of Wisconsin (RLG); Conselho bolsas de investigação de base-Tema Hong Kong Esquema Research T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM Dr2a-05394, e AHA Fundada Investigator Award (JCW); AHA pós-doutorado 12POST12050254 (PWB). Agradecemos a esperança Campbell no Citometria de Fluxo Núcleo do Instituto de Wisconsin Research sangue para obter assistência com a coleta de dados e análise criteriosa do manuscrito.

Materials

Name of Reagent / Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrix BD Biosciences 354277
Accutase cell detachment solution Stem Cell Technologies 7920
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) Sigma Aldrich D2650
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 53817
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor R&D Systems 1254
L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma Aldrich A8960-5G
Sodium selenite Sigma Aldrich S5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) Invitria 777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2) R&D Systems 4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) Peprotech 100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES Life Technologies 11330-032
Insulin Sigma Aldrich I9278-5ML
CHIR-99021 HCl Sellekchem S2924
IWR-1 Sigma Aldrich I0161
RPMI 1640 with L-Glutamine Life Technologies 11875-093
B-27 Supplement Minus Insulin Life Technologies A1895601
B-27 Supplement (with Insulin) Life Technologies 17504-044
Fetal bovine serum Life Technologies 10437
Flow cytometry reagents
Phosphate buffered saline (10X) Quality Biological Inc. 119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ Life Technologies 14175-095
BD Cytofix BD Biosciences 554655
BD Phosflow perm buffer III BD Biosciences 558050
16% Paraformaldehyde Thermo Scientific 28906
Methanol Sigma Aldrich 179957-4L
Acetone Mallenckrodt Chemicals  2440-16
Triton X-100 Amresco M236-10ML
Goat serum Life Technologies 16210-064
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250-061
Materials
5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) Corning 352008 for preparation of cells for flow cytometry
5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) Corning 352235 for preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbs Fischer Scientific 03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets BioExpress P-2904-2
0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green GeneMate C-3259-G
1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red GeneMate C-3260-R
TC20 automated cell counter BioRad 145-0102
Counting slides for TC20 BioRad 145-0011
6 well flat bottom tissue-culture treated plate Corning 353046
20 mL syringes BD Plastipak 300613 For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone VWR 28145-501 For filter sterilization of aliquots
250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431096 For filter sterilization of bulk media 
500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding  Corning 431097 For filter sterilization of bulk media 
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) Abcam ab19615 Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11) Thermo Scientific MA1-16687 Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) Synaptic Systems 310111 Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) Abcam AB131661 Primary antibody
Anti-IRX4   Bioss BS-9464R Primary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1  Life Technologies A21121 Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a Life Technologies A21241 Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b Life Technologies A21141 Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG R&D Systems F0110 Secondary antibody
Mouse IgG1 BD Biosciences 557273 Isotype Control
Mouse IgG2a eBiosciences 16-4724-81 Isotype Control
Rabbit IgG-PE R&D Systems IC105P Isotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTB Life Technologies Hs01060665
Brachyury T Life Technologies Hs00610080
CASQ2 Life Technologies Hs00154286
IRX4 Life Technologies Hs01100809
ISL1 Life Technologies Hs00158126
MESP1 Life Technologies Hs01001283
MYH11 (SMMHC) Life Technologies Hs00224610
MYH6 Life Technologies Hs01101425
MYL2 (MLC2v) Life Technologies Hs00166405
MYL7 (MLC2a) Life Technologies Hs01085598
MYOG Life Technologies Hs01072232
NKX2.5 Life Technologies Hs00231763
NPPA Life Technologies Hs01081097
POU5F1 Life Technologies Hs04260367
SOX17 Life Technologies HS00751752
TNNI1 Life Technologies Hs00913333
TNNI2 Life Technologies Hs00268536
TNNI3 Life Technologies HS00165957
TNNT2 Life Technologies Hs00165960
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Bhattacharya, S., Burridge, P. W., Kropp, E. M., Chuppa, S. L., Kwok, W., Wu, J. C., Boheler, K. R., Gundry, R. L. High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010, doi:10.3791/52010 (2014).
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