בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה
Summary
המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.
Abstract
יש צורך דחוף לפתח גישות לתיקון הלב הפגוע, שגילו תרופות טיפוליות חדשות שאין להם השפעות רעילות על הלב, ושיפור אסטרטגיות לדגמן מחלות לב באופן מדויק. הפוטנציאל של ניצול טכנולוגיה אנושית מושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSC) כדי ליצור שריר לב "בצלחת" עבור יישומים אלה ממשיך לייצר גבוהה התלהבות. בשנים האחרונות, את היכולת ליצור ביעילות תאי cardiomyogenic מתאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) השתפרה מאוד, מציעה לנו הזדמנויות חדשות למודל של פיתוח לב אנושי שלבים מוקדמים מאוד לא אחרת נגישות. בניגוד לרבים שיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש צבירת תא או תוספת של Activin או BMP4 וחסונה מייצר תרביות של תאים שהם חיוביים מאוד לטרופונין לבי וT (TNNI3, TNNT2), iroquois- חלבון homeodomain הכיתהIRX-4 (IRX4), שרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם חדרית / שריר לב (MLC2v) ושרשרת אור הרגולציה שרירן 2, איזופורם פרוזדורים (MLC2a) ביום 10 בכל תא הגזע העוברי האנושי (hESC) וקווי hiPSC נבדק כדי תאריך. ניתן passaged תאים ונשמרו במשך יותר מ 90 ימים בתרבות. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום וחסכוני. אפיון של שריר לב שמקורם בתאי pluripotent לעתים קרובות כולל ניתוח של סמני התייחסות, הן בmRNA ורמת חלבון. לניתוח חלבונים, cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת איכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות. עם זאת, וריאציה טכנית בהכנת מדגם יכולה באופן משמעותי להשפיע על איכות של cytometry זרימת הנתונים. לפיכך, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים צריכה לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול שונות. בהתאם לכך, מותאם פרוטוקולי צביעה לניתוח IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, וTNNT2 על ידי cytometry זרימה מתוארים.
Introduction
הדור של שריר לב מhPSCs, כולל hESC וhiPSC, יכול לתפקד כמודל במבחנה של תהליכים התפתחותיים לב אנושיים מאוד מוקדם, מתן תובנה שלבים לא אחרת נגישים למחקרים מכניסטית. מערכת מודל זה מספקת הזדמנויות ייחודיות ללמוד את המסלולים המולקולריים השולטים במחויבות שושלת לב ומפרט גורל תא. בשנים האחרונות, היכולת לייצר תאי cardiomyogenic ביעילות מhPSCs השתפרה 1-15 מאוד. עם זאת, בין פרוטוקולים יש וריאציה שורת תאים ביחס ליעילות ביצירת תאי cardiomyogenic ועיתוי שבו התאים להביע סמני תא ספציפי (לדוגמא, חדר ופרוזדורים). באופן אידיאלי, ליישומים עתידיים של מערכת מודל זה, אוכלוסיות הומוגניות יותר של תאים מוגדרים מבחינה תפקודית הן רצויים. בניגוד לשיטות קודמות, פרוטוקול בידול cardiomyocyte מתואר כאן אינו דורש ceצבירת ll או התוספת של חלבון Activin או עצם המוךפו"גנטי 4 (BMP4) ובאופן עמיד יוצרת תרבויות חיוביות מאוד עבור TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v, וMLC2a ביום 10 תאים על פני כל קווי hESC וhiPSC נוסו עד היום. האסטרטגיה היא פשוטה מבחינה טכנית ליישום, במיוחד בהשוואה לתרבויות תלת ממדים, תרבות המונים, או אסטרטגיות המבוססות גוף embryoid 4-9, והוגדרה לאחרונה במחקר שמתאר מולקולה קטנה עם רעילות סלקטיבית לhPSCs (Boheler et al. ) 65. תכונות של פרוטוקול זה כוללים בידול של hPSCs בתרבות monolayer באמצעות שכבה יחידה של מטריצה מוסמכת hESC (Matrigel), תקשורת מוגדרת באופן מלא באמצעות מולקולות קטנות לווסת איתות של Wnt (דומה, אך שונה מ1,2,7,13), ו זרימה מותאמת cytometry שיטות צביעה להערכת יעילות בידול וזהות תא. לסיכום, יתרונות של פרוטוקול זה בהשוואה לדוחות קודמים כוללים עלות effectiveness, שחזור, ויעילותו הגבוהה ליצירת שריר לב בקרב שורות hPSC מרובות, כולל קווי hESC וhiPSC.
Cytometry זרימה הוא כלי אנליטי רב עוצמה להערכת האיכות של תאים בתרבית וקביעת ההומוגניות תת אוכלוסיות, ועם עיצוב ניסיוני נכון, יכול לספק מדידות כמותיות. כמו בכל האסטרטגיות המבוסס על הנוגדן, פרשנות מדויקת של תוצאות ניסויים דורשת כי אלמנטים של עיצוב assay כוללים ריכוז נוגדנים וקיבעון ותנאי permeabilization (כאשר מיקוד אנטיגנים תאיים) נבדקים בקפידה עבור כל נוגדן כתנאים תת אופטימליים להשפיע על יעילות של נוגדן באופן משמעותי מחייב, ולכן, פרשנות של תוצאות. חשוב לציין, אם נדרש לכמת, נוגדנים חד שבטיים הם חיוניים, כמו נוגדנים polyclonal יכולים לזהות אפיטופים רבים ונוטים לוריאציה אצווה ל-אצווה. נכון לעכשיו, מגוון רחב של נוגדנים (פופרוטוקולי lyclonal וחד שבטיים) והצביעה תוארו להערכת בידול במבחנה, ולכן קשה להשוות את היעילות של cardiomyogenesis בין פרוטוקולי 1,2,9,11. מסיבה זו, נוגדנים חד שבטיים משמשים בעת זמינה עבור כל cytometry זרימת מנתח. במבט קדימה, הוא צפוי סטנדרטיזציה של פרוטוקולים מכתים אלה, במיוחד בכל הקשור לכימות, צריכים טוב יותר לאפשר השוואה בין אסטרטגיות בידול.
הבחירה של סמנים, והנוגדנים המקבילים שלהם, המשמש להערכת טוהר במבחנה cardiomyogenesis משתנים בין דיווחים. TNNT2 כבר נחשב מחוון של תאים מחויבים לגורל cardiomyogenic ומשמש באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של פרוטוקולי בידול לב. עם זאת, TNNT2 בא לידי ביטוי גם בשרירי שלד במהלך התפתחות אפרוח ועכברוש המוקדמת 16,17 והוא נמצא בשריר חלק אנושי 18 </sup>. לפיכך, TNNT2 אינו בהכרח סמן ספציפי של cardiomyogenesis האנושי במבחנה. MLC2v וMLC2a משמשים באופן שגרתי כסמנים פונדקאיות של תת חדרית ופרוזדורים, בהתאמה. עם זאת, אתגרים עם הסתמכות על MLC2v וMLC2a כדי לקבוע תת סוג cardiomyocyte בהקשר של בידול במבחנה נובעים מהעובדה שמוצרי גן אלה לא יכולים להיות מוגבלים לחדר ספציפי בכל התפתחות של הלב, מצינור לב דרך מבוגר. במכרסמי כרך לב, MLC2a mRNA הוא השולט בפרוזדורים / האזור בדרכי יבוא וMLC2v mRNA הוא השולט באזורי מערכת חדרית / יצוא. בלב הכרך, שיתוף ביטוי של MLC2a וMLC2v mRNAs הם נצפו במערכת יבוא, תעלה בין עליות וחדרים, ומערכת יצוא 19,20. על ידי 3 ימים לאחר לידה, MLC2v mRNA מוגבל לחדר ועל ידי 10 ימים לאחר לידה, MLC2a מוגבל לפרוזדורים בלב החולדה בילוד 19. לכן, פרשנותנתונים על יעילות cardiomyogenesis וזהות תת סוג חייבת לא רק לקחת בחשבון את הנוכחות והכמות של רמות סמן התייחסות, אך יש לקחת בחשבון את השלב ההתפתחותי (ים) שנקודתי הזמן של בידול שמנותחים מתאימות. זה חשוב במיוחד בהתחשב בכך שהשלב ההבשלה של תאי cardiomyogenic שנוצרו על ידי במבחנה בידול של hPSCs הדומה ביותר אלה של התפתחות העובר / עוברית 21-25. לפיכך, בהסתמך על הביטוי המרחבי של סמן בלב לאחר הלידה לא יכול להיות מתאים להערכת נגזרים תאי hPSC, לפחות בחלק מהמקרים.
במאמץ להקל על הפיתוח של קריטריונים ספציפיים יותר להגדרת זהות cardiomyocyte במבחנה, TNNI3 נחשב סמן חשוב להערכת cardiomyogenesis במבחנה כפי שהוא מוגבל לשריר לב בכל עובר בחומוס ודג הזברה 15,20והוא נעדר בשרירי שלד של העובר אנושי 26. בעוד TNNI1 נמצא בלבו של העובר אנושי, TNNI3 הוא הווה איזופורם TNNI רק בלב מבוגר נורמלי 27,28. לגבי זהות תת סוג cardiomyocyte, IRX4 29-31 הוא סמן אינפורמטיבי של תאים עם גורל חדרית. ברמת החלבון, IRX4 לאחרונה הוכח להיות מוגבל לחדר מצינור לב ליניארי דרך שלבים בילוד בעכבר 32. בהתאם לכך, פרוטוקולי צביעה מותאמות לניתוח TNNI3 וIRX4 ידי cytometry זרימה מתוארים. למיטב ידיעתנו, זה הוא התיאור הראשון של שיטה לצביעה יעילה המבוסס על נוגדן וניתוח של רמות IRX4 בשריר לב אנושי על ידי cytometry זרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
קריטי להצלחה של פרוטוקול הבידול הוא השימוש בתרבויות באיכות גבוהה של hPSCs כי כבר passaged ברמת התא הבודד לפחות חמישה קטעים שקדמו לתחילתו של בידול. יעילות בידול דומה נצפתה באופן שיגרתי בין קווי hPSC שונים אם הם מחוברות 100% בתחילת הבידול, עצמאיות של שורת תאים. היעילות הכי מוצלחת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי NIH 4R00HL094708-03, ענייני מחקר MCW ועדת ניו פקולטה פרס, וקרן קרן (קופות אתחול) במכללה הרפואית של ויסקונסין (RLG); מועצה למחקר מענקים של תכנית מחקר T13-706 / 11 (KRB) המבוסס על ערכת נושא הונג קונג; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05,394, וAHA נוסד פרס חוקר (JCW); AHA דוקטורים המלגה 12POST12050254 (PWB). אנו מודים התקווה קמפבל בcytometry הזרימה Core של דם מכון המחקר של ויסקונסין לסיוע באיסוף הנתונים ובדיקה מעמיק של כתב היד.
Materials
| Name of Reagent / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC-qualified matrix | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase cell detachment solution | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-136 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitor | R&D Systems | 1254 | |
| L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | R&D Systems | 4144-TC-01M | |
| Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 with L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 Supplement Minus Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 Supplement (with Insulin) | Life Technologies | 17504-044 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10437 | |
| Flow cytometry reagents | |||
| Phosphate buffered saline (10X) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Acetone | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Goat serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Materials | |||
| 5 ml round bottom polystyrene tube (without cap) | Corning | 352008 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 5 ml round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap) | Corning | 352235 | for preparation of cells for flow cytometry |
| 2 ml rubber bulbs | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipets | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 mL microcentrifuge tubes, graduated, green | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, graduated, red | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 automated cell counter | BioRad | 145-0102 | |
| Counting slides for TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| 20 mL syringes | BD Plastipak | 300613 | For filter sterilization of aliquots |
| Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfone | VWR | 28145-501 | For filter sterilization of aliquots |
| 250 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431096 | For filter sterilization of bulk media |
| 500 mL filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low binding | Corning | 431097 | For filter sterilization of bulk media |
| Antibodies and Isotype Controls | |||
| Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7)) | Abcam | ab19615 | Primary antibody |
| Anti-TNNT2 (clone: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primary antibody |
| Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5) | Synaptic Systems | 310111 | Primary antibody |
| Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primary antibody |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 | Life Technologies | A21121 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2a | Life Technologies | A21241 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2b | Life Technologies | A21141 | Secondary antibody |
| Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgG | R&D Systems | F0110 | Secondary antibody |
| Mouse IgG1 | BD Biosciences | 557273 | Isotype Control |
| Mouse IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | Isotype Control |
| Rabbit IgG-PE | R&D Systems | IC105P | Isotype Control |
| TaqMan Probesets for qRT-PCR | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
References
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
- Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
- Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
- Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
- Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
- Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
- Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
- Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
- Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
- Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
- Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
- Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
- Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
- Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
- Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
- Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
- Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
- Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
- Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
- Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
- Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
- Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
- Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk–sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
- Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
- Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
- Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1. HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
- Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
- Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
- Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
- Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
- Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
- Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
- Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
- Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
- Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
- Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
- Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
- Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
- Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
- Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
- Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
- Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
- Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
- Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
- Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
- Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
- Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
- Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao, ., Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).
