本文详细描述了通过选择性调控Wnt信号通路，将人多能干细胞高效分化为心肌细胞的方法，并随后通过流式细胞术分析参考标志物，以评估细胞群体的均一性和身份特征。
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方法文章
高效率诱导人多能干细胞分化为心肌细胞及通过流式细胞术进行表征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
迫切需要开发修复受损心脏的方法，发现对心脏无毒副作用的新型治疗药物，并改进精确模拟心脏病的策略。利用人诱导性多能干细胞（hiPSC）技术在“培养皿中”生成心肌细胞以实现上述应用，这一潜力持续引发高度关注。近年来，从人多能干细胞（hPSCs）高效生成心肌细胞的能力已显著提高，为我们研究以往难以触及的人类心脏早期发育阶段提供了新的机遇。与许多以往的方法不同，本文所述的心肌细胞分化方案无需细胞聚集，也无需添加Activin A或BMP4，且在迄今为止测试的所有人胚胎干细胞（hESC）和hiPSC细胞系中，均可在第10天稳定地获得高比例表达心脏肌钙蛋白I和T（TNNI3, TNNT2）、Iroquois类同源结构域蛋白IRX-4（IRX4）、肌球蛋白调节轻链2心室/心肌同工型（MLC2v）以及肌球蛋白调节轻链2心房同工型（MLC2a）的细胞培养物。这些细胞可在体外传代并维持培养超过90天。该策略在技术上易于实施且成本效益高。对多能干细胞来源的心肌细胞进行表征时，通常需在mRNA和蛋白质水平上分析参考标志物。在蛋白质分析中，流式细胞术是一种强大的分析工具，可用于评估培养细胞的质量并确定亚群的均一性。然而，样本制备过程中的技术差异会显著影响流式细胞术数据的质量。因此，标准化染色方案将有助于不同分化策略之间的比较。为此，本文描述了用于通过流式细胞术分析IRX4、MLC2v、MLC2a、TNNI3和TNNT2的优化染色方案。
引言
由人多能干细胞（hPSCs），包括人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC），分化生成心肌细胞，可作为 体外 极早期人类心脏发育过程的模型，为通常难以通过机制研究获取的发育阶段提供了深入见解。该模型系统为研究调控心脏谱系承诺和细胞命运决定的分子通路提供了独特的机会。近年来，从人多能干细胞（hPSCs）高效生成心肌细胞的能力已显著提升1-15然而，不同实验方案在生成心肌细胞的效率以及细胞表达心室特异性标志物的时间上存在细胞系间的差异。例如心室和心房）。理想情况下，为了该模型系统的未来应用，需要获得功能定义更明确且更为均一的细胞群体。与以往方法不同，本文所述的心肌细胞分化方案无需细胞聚集，也无需添加激活素A（Activin A）或骨形态发生蛋白4（BMP4），在所有迄今测试的人胚胎干细胞（hESC）和人诱导多能干细胞（hiPSC）系中，均可在第10天高效地获得TNNI3、TNNT2、IRX4、MLC2v和MLC2a高度阳性的细胞培养物。该策略在技术上易于实施，尤其相较于三维培养、大规模培养或基于拟胚体的策略而言更为简便。4-9，并在最近一项研究中被定义，该研究描述了一种对人多能干细胞（hPSCs）具有选择性毒性的小分子（Boheler 等)65该方案的特点包括在单层培养体系中使用经hESC验证的基质（Matrigel）进行hPSC的分化，以及采用小分子调控Wnt信号通路的完全定义培养基（类似但不同于
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方案
1. 溶液与培养基的配制
- 人胚胎干细胞合格基质涂层储备液
- 将人胚胎干细胞合格基质（5 ml）置于冰上，在 4 ºC 条件下过夜缓慢解冻。分装至预冷的无菌 1.5 ml 微量离心管中，并立即于 -20 ºC 保存。
注意：分装体积因批次而异，通常为 270–350 µl。制造商提供将分装液稀释至 25 ml 后达到 1x 浓度所需的分装体积详情，详见步骤 2.1。
- 将人胚胎干细胞合格基质（5 ml）置于冰上，在 4 ºC 条件下过夜缓慢解冻。分装至预冷的无菌 1.5 ml 微量离心管中，并立即于 -20 ºC 保存。
- 人多能干细胞培养基储备液
- 除非另有说明，使用超纯水作为稀释剂。所有组分均使用 0.22 µm 滤器进行除菌。以下组分以大包装溶液形式于 4 ºC 保存：碳酸氢钠（75 mg/ml）；柠檬酸（10 mM，pH = 3）。
- 所有组分使用 0.2 µm 注射器滤器除菌，并分别分装后于 -20 ºC 保存：Rho 激酶（ROCK）抑制剂 Y-27632（10 mM，溶于 DPBS，100 µl 分装）；L-抗坏血酸-2-磷酸（64 mg/ml，500 µl 分装）；亚硒酸钠（70 µg/ml，100 µl 分装）；转铁蛋白（50 mg/ml，107 µl 分装）；成纤维细胞生长因子 2（FGF2；200 ng/µl，溶于 DPBS，250 µl 分装）；转化生长因子 β1（TGFβ1，100 ng/µl，溶于冷的 10 mM 柠檬酸，10 µl 分装）。
- 人多能干细胞培养基 E....
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结果
第0天时，细胞融合度达到100%，形态紧凑，细胞碎片极少。在第1-2天，常可观察到明显的细胞死亡（40-50%），但贴壁细胞仍保持紧凑的形态（图1A）。此时培养基呈橙色且浑浊。若培养基变为粉红色，提示细胞死亡过度，应通过台盼蓝染色确认，若细胞死亡率超过70%，则应终止实验。细胞在第3-4天开始恢复，密度逐渐增加。第5-6天时，细胞死亡极少，可能出现致密细胞区域。至第7-8天，形成融合的单层细胞，形态紧凑，并散布有致密区域。细胞通常在第8天开始出现自发性收缩，最初的收缩多见于致密区域。到第10天，收缩更为有力，并在随后几天内逐渐扩散至整个培养层。α-肌动蛋白in和TNNT2的免疫细胞化学染色显示肌节结构（图1A）。通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测，中胚层及心肌定向分化标志物的mRNA表达水平呈现预期的时间表达谱（图1B），包括心脏标志物Nkx-2.5同源盒蛋白（NKX2.5）、TNNI3、MLC2a、MLC2v和肌球蛋白-6（MYH6）的显著表达。平滑肌（肌球蛋白重链11，MYH11）和骨骼肌（生肌素，MYOG）标志物的表.......
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讨论
分化方案成功的关键在于使用高质量的hPSC培养物，这些细胞在开始分化前应至少经过五次单细胞水平的传代。如果各种hPSC细胞系在分化起始时均达到100%汇合度，则其分化效率通常相似，且与细胞系本身无关。若分化起始时细胞汇合度≤95%或>100%，则会观察到次优的分化效率。因此，应针对每种细胞系仔细优化接种密度和传代时机，以确保在分化开始时获得100%汇合的单层细胞。在这方面，以每孔明确的细胞数量进行接种，而非使用传代比例，可快速实现该方案的成功实施，且不受操作者经验的影响，因为它消除了通过肉眼估计汇合度的主观性。也可使用商业化配制的E8培养基，尽管本文详述的配方具有显著的成本优势。作为hESC认证基质的替代方案，已成功使用生长因子减少型、LDEV-Free的hESC认证基质。常规传代也可使用基于EDTA的细胞解离溶液完成。虽然在第8天后可在不添加血清的情况下将细胞维持在分化培养基#2中，但当添加2% FBS时可观察到更高的细胞存活率；但需注意，血清可能在体外引起心肌细胞肥大。in vitro。当需要用于临床应用时，有可能优化本方案，使其无需添加FBS，并可在无异源成分且完全明确的替代基质上进行，但这些条件尚未在本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）4R00HL094708-03项目、威斯康星医学院研究事务委员会新教员奖、威斯康星医学院Kern基金会（启动资金）（RLG）；香港研究资助局主题研究计划T13-706/11（KRB）；U01 HL099776、CIRM TR3-05556、CIRM DR2A-05394及美国心脏协会资深研究者奖（JCW）；美国心脏协会博士后奖学金12POST12050254（PWB）资助。我们感谢威斯康星血液研究所流式细胞术核心实验室的Hope Campbell在数据收集以及稿件审阅方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞培养 | |||
| BD Matrigel，hESC鉴定合格基质 | BD 生物科学 | 354277 | |
| Accutase 细胞解离液 | 干细胞技术 | 7920 | |
| 不含钙、镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Life Technologies | 14190-136 | |
| 二甲基亚砜（DMSO，Hybri-Max，经无菌过滤） | Sigma Aldrich | D2650 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | 53817 | |
| 柠檬酸 | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 二盐酸盐选择性p160ROCK抑制剂 | R&D Systems | 1254 | |
| L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物 | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| 亚硒酸钠 | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| 转铁蛋白（Optiferrin） – 明确的、无动物成分的、重组人源 | Invitria | 777TRF029 | |
| 成纤维细胞生长因子2（FGF2） | R&D系统 | 4144-TC-01M | |
| 转化生长因子β1（TGF-β1）在多种细胞过程中发挥关键作用，包括细胞增殖、分化、凋亡和细胞外基质的生成。该因子在组织修复、免疫调节和肿瘤发生中具有双重功能，既可抑制早期肿瘤发展，又可促进晚期肿瘤的侵袭与转移。TGF-β1通过与细胞表面的特异性受体结合，激活Smad依赖性和非Smad依赖性信号通路，从而调控靶基因的表达。其活性受到多种内源性和外源性因素的精细调控，包括其他细胞因子、微环境变化以及表观遗传修饰。在纤维化疾病中，TGF-β1的过度表达与胶原沉积和器官功能障碍密切相关。因此，针对TGF-β1信号通路的干预已成为多种疾病治疗策略的研究热点。关键词：转化生长因子β1，TGF-β1，信号通路，Smad蛋白，细胞增殖，细胞分化，纤维化，肿瘤进展β1) | Peprotech | 100-21 | |
| 含L-谷氨酰胺和15 mM HEPES的DMEM/F12培养基 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 胰岛素 | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| 含L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基 | Life Technologies | 11875-093 | |
| B-27 补充剂（不含胰岛素） | Life Technologies | A1895601 | |
| B-27 补充剂（含胰岛素） | Life Technologies | 17504-044 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10437 | |
| <强>流式细胞术试剂 | |||
| 磷酸盐缓冲液（10倍浓缩） | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| 不含钙的汉克平衡盐溶液2+ 和 Mg2+ | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD 生物科学 | 554655 | |
| BD Phosflow 透化缓冲液 III | BD 生物科学 | 558050 | |
| 16% 多聚甲醛 | 赛默飞世尔科技 | 28906 | |
| 甲醇 | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| 丙酮 | Mallenckrodt Chemicals | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| 山羊血清 | Life Technologies | 16210-064 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Life Technologies | 15250-061 | |
| <强>材料 | |||
| 5 ml 圆底聚苯乙烯管（无盖） | 康宁 | 352008 | 用于流式细胞术的细胞制备 |
| 5 ml 圆底聚苯乙烯管（带 35 µM细胞滤筛带卡扣盖 | 康宁 | 352235 | 用于流式细胞术的细胞制备 |
| 2 ml 橡胶吸头 | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" 未堵塞的硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0.65 ml 微型离心管，带刻度，绿色 | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 ml 微量离心管，带刻度，红色 | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 自动细胞计数仪 | 伯乐（BioRad） | 145-0102 | |
| TC20细胞计数板 | BioRad | 145-0011 | |
| 6孔平底组织培养板 | 康宁 | 353046 | |
| 20 ml 注射器 | BD Plastipak | 300613 | 用于分装样品的滤膜除菌 |
| 无菌注射器滤器，0.2 µm 聚醚砜 | VWR | 28145-501 | 用于分装样品的滤膜除菌 |
| 250 ml 过滤系统，0.22 µm 聚醚砜，无菌，低吸附 | 康宁 | 431096 | 用于大量培养基的滤膜除菌 |
| 500 ml 过滤系统，0.22 µm 聚醚砜，用于灭菌，低吸附 | 康宁 | 431097 | 用于大量培养基的滤膜除菌 |
| <强>抗体与同型对照 | |||
| 抗TNNI3（克隆：284 (19C7)） | Abcam | ab19615 | 一抗 |
| 抗TNNT2（克隆：1C11） | 赛默飞世尔科技 | MA1-16687 | 一抗 |
| 抗MYL2（MLC2v，克隆号：330G5） | Synaptic Systems | 310111 | 一抗 |
| 抗MYL7（MLC2a，克隆：4E7） | Abcam | AB131661 | 一抗 |
| 抗IRX4 | Bioss | BS-9464R | 一抗 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG1 | Life Technologies | A21121 | 二抗 |
| Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 IgG2a | Life Technologies | A21241 | 二抗 |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG2b | Life Technologies | A21141 | 二抗 |
| 藻红蛋白（PE）山羊抗兔IgG | R&D Systems | F0110 | 二抗 |
| 小鼠 IgG1 | BD 生物科学 | 557273 | 同型对照 |
| 小鼠 IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | 同型对照 |
| 兔IgG-PE | R&D Systems | IC105P | 同型对照 |
| <强>用于qRT-PCR的TaqMan探针组 | |||
| ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11（SMMHC） | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2（MLC2v） | Life Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7（MLC2a） | Life Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
参考文献
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al.
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