小鼠肾上腺嗜铬细胞膜电容细胞贴附式测量方法

摘要

胞吐作用后，融合的质膜通过一种称为内吞作用的过程被回收。该机制可重新形成新的突触小泡，以供下一轮释放使用。通过在小鼠肾上腺嗜铬细胞中采用细胞贴附式电容记录技术，可捕获并分析单个内吞事件。

摘要

神经元传递是大脑内细胞间通信的重要组成部分。突触前膜去极化会导致囊泡融合，这一过程称为介导突触传递的胞吐作用。随后突触囊泡的回收对于生成新的神经递质填充囊泡至关重要，该过程被称为胞吞作用。在胞吐过程中，融合的囊泡膜将导致细胞表面积增加，而随后的胞吞作用则使表面积减少。本文中，本实验室展示了对小鼠肾上腺嗜铬细胞中单个胞吞事件进行细胞贴附式电容记录的基本方法。这种电生理记录技术可用于在单个囊泡水平上高分辨率地记录胞吐和胞吞过程。尽管该技术能够检测囊泡的胞吐和胞吞，但本实验室的研究重点是囊泡的胞吞作用。此外，该技术使我们能够分析单个胞吞事件的动力学特征。本文将介绍小鼠肾上腺组织的解剖方法、嗜铬细胞的培养、基本的细胞贴附技术，以及测量单个胞吞事件的典型记录示例。

引言

突触传递通过含有神经递质的突触小泡的胞吐作用介导，而这些突触小泡必须在神经末梢内进行局部的内吞再循环，以长期维持神经元间的通信。鉴于突触传递在大脑功能中的关键作用，阐明构成突触小泡循环的分子机制，是全面理解细胞间通信的基础。在各类细胞模型系统中，肾上腺嗜铬细胞为揭示突触小泡再循环的分子机制提供了最具决定性的见解之一。作为神经递质释放的最终步骤，胞吐作用已通过肾上腺嗜铬细胞得到了广泛而深入的研究^1,2。事实上，由于在嗜铬细胞中应用了多种技术，参与分泌颗粒形成、靶向、停靠和融合过程的大多数分子参与者已被鉴定出来¹。此外，嗜铬细胞能够实现对参与胞吐过程的蛋白质机器进行单小泡水平的观察，因此它仍然是研究小泡融合问题的一个强大模型系统³。

细胞贴附式电容测量最初被用于解析胞吐过程中单个囊泡的融合事件³。已有研究表明，利用膜片钳技术在细胞贴附构型下，通过细胞膜导纳测量可检测到直径小至约60 nm的囊泡的胞吐过程^4-7。导纳定义为衡量电路或器件允许电流通过难易程度的物理量，是阻抗的倒数。因此，导纳测量可反映细胞膜电容的变化。当囊泡膜融合并整合入质膜时，会引起膜表面积的改变⁸。每一个融合的囊泡都会导致膜电容出现阶跃式增加^9,10。此外，该导纳测量方法还能在胞吐事件期间提供膜电导和融合孔电导的信息³。由于该技术为研究胞吐过程中单个囊泡的动力学提供了独特的手段，我们实验室近期已将此方法应用于检测单个囊泡的内吞过程^11,12。

我们的研究重点是网格蛋白介导的内吞作用（clathrin-mediated endocytosis, CME），该过程被认为是多种细胞中的基本维持机制¹³，也是神经元末梢突触囊泡内吞的主要通路^14,15。尽管已知CME在生物学上具有重要意义，但由于技术限制难以监测单个内吞事件，其动力学过程仍不甚清楚。鉴于嗜铬细胞与神经元在胞吐机制上的相似性¹，嗜铬细胞中的膜裂变机制很可能也适用于神经元中的突触囊泡内吞过程。细胞贴附式电容测量技术已被用于监测单个内吞事件并分析膜裂变动力学，而大多数其他方法无法实现这一分辨率。在我们的细胞贴附记录中，一个20 kHz的正弦波叠加在保持电位上，输出电流通过双相锁相放大器分离为两个通道：一个通道记录膜电导，另一个通道记录膜电容^16-18。通过分析膜电导和膜电容的变化，可以计算出裂变孔道的动力学参数，该孔道很可能对应于囊泡从质膜内化前连接两者之间的管状膜颈结构。总体而言，该技术使我们能够深入探究CME过程中囊泡裂变的调控机制。

方案

注意：整个操作过程均按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经由伊利诺伊大学芝加哥分校动物护理与使用委员会批准。

1. 溶液与培养基的配制

1. 所有溶液在 -20 °C 保存，可稳定长达六个月。培养基在 4 °C 保存，可稳定长达三个月。
2. 在100 ml DMEM中加入1 ml青霉素-链霉素溶液和1 ml ITSX（胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂），配制100 ml培养基。
3. 通过混合250 ml DMEM和2.5 ml 100 mM CaCl₂来配制酶溶液₂，以及 2.5 ml 的 50 mM EDTA。
4. 将225 ml DMEM、25 ml FBS、625 mg白蛋白和625 mg胰蛋白酶抑制剂混合，配制灭活溶液。
5. 配制含有154 mM NaCl、5.6 mM KCl、5.0 mM HEPES、3.6 mM NaHCO3和5.6 mM葡萄糖的Locke氏溶液，用NaOH调节pH至7.3。
6. 配制50 mg/ml的多聚-d-赖氨酸（PDL）溶液。使用终浓度为1 mg/ml的PDL溶液包被盖玻片。
7. 配制一种细胞外溶液，含 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂₂，1 mM MgCl₂，10 mM HEPES-NaOH 和 10 mM 葡萄糖。用 NaOH 调节 pH 至 7.3，渗透压约为 310 nmol/kg。
8. 配制含有 50 mM NaCl、100 mM TEACl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂ 的移液管溶液₂，1 mM MgCl₂，以及10 mM HEPES。用NaOH调节pH至7.3，渗透压约为290 nmol/kg。

2. 肾上腺分离

1. 将一把大剪刀和一把小剪刀以及两对镊子进行高压灭菌。整个操作过程中佩戴手套，并将解剖托盘置于冰桶上。
2. 使用出生第0至3天的小鼠。先用加压的CO₂气罐实施安乐死，随后进行断头处理。
3. 使用较小的剪刀沿幼鼠脊柱方向，从颈椎至尾椎区域沿背部剪开皮肤。注意仅在皮下浅层剪开，避免刺入体腔。
4. 接着将皮肤从脊柱两侧剥离，暴露肌肉组织，以便清晰观察脊柱。在此基础上，先在颈椎部位的脊髓处做横切口，然后沿脊柱两侧做两条平行切口。
5. 用一对镊子固定动物主体部分，用另一对镊子夹住脊柱并向后剥离，直至肾脏暴露。
6. 此时可观察到位于肾脏上方的肾上腺。随后小心地将每只动物的两个肾上腺转移至装有Locke氏液的锥形管中。
   注意：有时腺体会粘附在镊子上。若出现此情况，可轻轻使用另一对镊子协助将腺体从镊子上取下并放入Locke氏液中。腺体在此条件下最多可保存2小时。

3. 组织消化

1. 在此期间，在使用前将酶溶液用 5% CO₂ + 95% O₂ 气体鼓泡 15 分钟。确保平衡后的溶液由亮粉色变为粉橙色。
2. 将木瓜蛋白酶加入 freshly 鼓泡的酶溶液中，终浓度为 20–25 单位/毫升。将每只动物的一对腺体置于含木瓜蛋白酶的酶溶液中，37 °C 孵育 40–60 分钟。
3. 向每管中加入 75% 的灭活溶液，再于 37 °C 孵育 10 分钟。此孵育步骤可灭活木瓜蛋白酶的酶活性。
4. 与灭活溶液孵育 10 分钟后，轻柔地将腺体转移至新标记的离心管中，随后用培养基洗涤腺体 3 次。

4. 细胞解离与接种

1. 洗涤后，将两个腺体放入 200 µl 培养基中，然后 轻柔地 用200 µl移液枪通过枪头将腺体在溶液中反复吹打，直至溶液中无大块组织残留。
   注意：滴定时，使用200 µl移液器枪头对管底的腺体施加向下的力，以保持腺体位于管底，并轻柔缓慢地操作，避免剧烈或快速移液。务必采用缓慢、连续的吹打动作，切勿快速或突然吸液和排液。
2. 加入额外的250 µl培养基，使培养基总体积达到450 µl。
3. 将60 µl含细胞的溶液分别接种到7个12 mm多聚赖氨酸预包被的盖玻片上，每个盖玻片置于60 × 15 mm培养皿中。
4. 接种后，将培养皿放入设定为37 °C并持续供应5% CO₂的培养箱中₂ 孵育30分钟，以确保细胞存活环境。孵育结束后，轻柔加入5 ml预热的培养基至培养皿中，将培养皿放回培养箱继续培养24小时，之后进行细胞贴附式记录。
   注意：通常情况下，细胞可用于电生理记录长达4天。

5. 细胞识别与吉欧姆封接形成

1. 将12 mm盖玻片放入细胞外溶液中。由于使用完整的肾上腺进行细胞制备，因此在培养物中，嗜铬细胞（通常非常明亮，呈棕褐色/米色，形态接近完美的圆形（图1））会与皮质细胞（比嗜铬细胞更小且更暗）混合存在。
2. 使用可编程P-97拉制仪分四个阶段拉制膜片钳电极。将电极尖端浸入熔化的石蜡中，以降低玻璃的电容，然后进行明火抛光，将石蜡从电极尖端内部“烧除”。
   注意：当用膜片钳电极溶液填充时，膜片钳电极的电阻通常约为 ~2 MΩ。
3. 将膜片钳电极靠近细胞至数微米范围内。为获得细胞附着式构型，在电极接近细胞时观察细胞是否出现轻微变形。施加轻柔的负压，直至形成吉欧姆（GΩ）级封接。

6. 细胞贴附式电容记录

1. 当出现 GΩ 封接时，使用 EPC-7 plus 膜片钳放大器和双相模拟锁相放大器进行细胞贴附记录（参见所附设备表）。从锁相放大器施加幅值为 50 mV（均方根值）和频率为 20 kHz 的正弦波信号。
2. 将锁相放大器的输出滤波器设置为 1 毫秒时间常数和 24 db。调节锁相放大器的相位，使由轻柔吸吮脉冲引起的瞬时电容变化仅出现在膜片电容（Im）轨迹中，而不会投影到膜片电导（Re）轨迹中（图 2）。
   注意：系统校准的详细信息请参见参考文献 19。
3. 通过“向下”阶跃识别典型的电容变化（图 3）。
   注意：良好的记录表现为类似“阶梯”状，包含多个向下的阶跃，表明单个囊泡正在内化。膜片钳制过程本身是一种机械刺激，因为通常可在大多数细胞中记录到动作电流。
4. 将文件命名为独立文件夹，包含日期：年/月/日，并将每个细胞贴附记录在该文件夹内以独立编号（xx）命名。

结果

细胞活性和吉欧姆封接的质量对于决定细胞贴附式电容记录的质量至关重要。因此，在进行电生理记录之前，获得高效且有效的细胞培养尤为关键，典型的活细胞如图1所示。通过实践和经验积累，有助于实现高质量的吉欧姆封接。如果在贴附式记录移液管接近细胞时（如方案步骤5.3所述）能够清晰观察到细胞形变，则更有可能获得高质量的封接。图3展示了一次典型的膜电容记录结果，其中出现多个向下的阶跃，对应单个囊泡内吞事件。

图1. 小鼠肾上腺嗜铬细胞培养24小时后的存活细胞示例。 箭头指向3个存活的嗜铬细胞。...

讨论

进行细胞贴附式电容测量需要完成多个关键步骤，才能成功获得高质量的记录：1）从肾上腺组织制备出具有活性且健康的细胞；2）盖玻片的多聚赖氨酸（PDL）包被；3）吉欧姆（gigaohm）封接的形成；4）系统的噪声水平控制；以及 5）相位校正。

进行动物手术时，可考虑调整手术入路，以更好地适应操作灵活性，并防止解剖过程中造成损伤。此外，充分练习定位和摘除肾上腺至关重要，因为用于电生理记录的细胞完全来源于肾上腺髓质。对于酶消化步骤，必须通过通入5% CO₂ + 95% O₂气体来平衡酶溶液。确保连接气瓶的管路足够且连接紧密，无泄漏。同时，在整个15分钟的通气过程中，确保管路末端始终正确置于溶液中；可通过在管路末端连接一个已钝化的20 G针头，以适当引导气流方向。此外，只要气流不至于强到导致管内溶液溢出，适当延长此步骤的时间并无不良影响。细胞吹打（titration）是另一个需要反复练习的关键环节。若吹打过度，大部分细胞可能受损；反之，若吹打不足，则从组织中解离出的单个孤立细胞将非常稀少。为有效进行吹打，应使用200 µl移液枪头上下吹打7–8次，并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-D-赖氨酸	Sigma	P0899
DMEM		15066024	避免紫外线
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基	Life Technologies
盖玻片	Carolina Biological	633029	12 mm
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140122	100 ml
胰岛素-转铁蛋白-硒-X	Life Technologies	51500056	仅可在冰上解冻！
木瓜蛋白酶	Worthington	39S11614
EPC-7 plus 膜片钳放大器	HEKA
BNC-2090 数据采集板	国家仪器公司
Igor 数据采集软件	Wavemetrics
P-97 玻璃微电极拉制仪	Sutter Instruments
显微烧制仪	Scientific Instruments
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instruments	B150-110-10	外径：1.5 mm 内径：1.10 mm 长度：10 cm