マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法
Summary
After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.
Abstract
Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.
Introduction
シナプス伝達は、神経伝達物質を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスによって媒介され、これらの小胞は、長期的にはニューロンの通信を維持する神経末端内のローカルエンドサイトーシスのリサイクルを受けなければならない。脳内のシナプス伝達の重要な役割を考えると、シナプス小胞サイクルを構成している分子機構を理解することは、全体としてセルラ通信でより良い理解に向けて不可欠な基盤である。細胞モデル系の中では、副腎髄質細胞は、シナプス小胞のリサイクルの根底にある分子機構に最も決定的な洞察のいくつかを提供してきました。エキソサイトーシス、神経伝達物質放出の最終段階は、非常に学び、副腎クロマフィン細胞1,2を使用することによって検討されている。実際には、分泌顆粒の形成、ターゲティング、ドッキングおよび融合を調整する分子の選手のほとんどが原因のdivの適用に同定されているクロマフィン細胞1におけるERSEテクニック。さらに、エキソサイトーシスに関与するタンパク質合成機構の単一小胞の解決を可能にする機会を提供することにより、クロム親和性細胞は、小胞融合3の問題に対処するための強力なモデルのままです。
細胞結合型の静電容量の測定は、第3エキソサイトーシスの間に単一小胞の融合を解決に利用した。直径60nmのセル接続構成4-7のパッチクランプ技術を用いて細胞膜アドミタンス測定によって検出されることが実証されている〜と小さい小胞のエキソサイトーシス。アドミタンスは、回路またはデバイスは、電流が流れることを可能にする方法を簡単の尺度として定義される。それは、インピーダンスの逆数である。このように、アドミタンス測定値は、膜キャパシタンスの理解を提供する。これは、原形質膜への小胞の膜を組み込むことによって達成される。この取り込みは、表面の変化を明らかにエリア8。各融合する小胞は、膜キャパシタンス9,10段階的増加を引き起こす。また、このアドミタンス測定は、膜コンダクタンスとエキソサイトーシス事象3時の融合孔コンダクタンスを提供しています。この技術は、エキソサイトーシスの間に単一小胞の動態を同定することをユニークなツールを提供してきたように、私たちの研究室は最近、単一の小胞11,12のエンドサイトーシスを検出するために、この概念を適用しております。
私たちの具体的な関心は、多くの細胞の基本的なハウスキーピング部品13として、および神経端子14,15におけるシナプス小胞エンドサイトーシスのための主要な経路と考えられてきたクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、である。 CMEは、生物学的に重要であることが知られているが、その動態は、単数エンドサイトーシスイベントを監視する技術的な制限のためによく理解されていないままである。マフィン細胞と神経細胞1との間のエキソサイトーシスの機構の類似性を考えると、PLはクロマフィン細胞での分裂メカニズムはおそらくニューロンにシナプス小胞エンドサイトーシスに適用することができることがausible。細胞結合型の静電容量の測定は、個別のエンドサイトーシスイベントを監視し、ほとんどの方法は、解決できない核分裂反応速度を分析するために利用されてきた。私達のセルに接続された記録では、20kHzの正弦波は、保持電位上に重畳され、出力電流は、二相ロックインアンプから他のチャネルでのチャネル及び膜キャパシタンスに膜コンダクタンスに分離される16 18。膜コンダクタンスと静電容量の変化から、人はおそらく小胞ピンチオフする前に細胞膜に内在化小胞をつなぐ管状膜ネックに対応核分裂細孔の動態を計算することができます。総称して、この技術は私たちにCMEの中に小胞分裂の調節メカニズムを検討する機会を与えてくれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
セルに接続された静電容量測定に成功し、高品質での録音を得るためには、いくつかの重要なステップが必要です：副腎から調製1）生存し、健康な細胞;カバースリップの2）、PDLコーティング; 3）ギガオームシール形成; 4）システムのノイズレベル;および5）位相補正。
動物を手術のために、一つは、潜在的な修正は、最も適した器用に外科的アプローチを調整し、解剖…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a National Science Foundation award (1145581) to LWG.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100mL |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter-1.5 mm |
| Inner diameter 1.10 mm | |||
| Length- 10 cm |
References
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochimica et Biophysica Acta. 1641, 167-173 (2003).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P. Cell biology of the presynaptic terminal. Annu Rev Neurosci. 26, 701-728 (2003).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
