Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Summary

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Abstract

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

Synaptischen Übertragung wird durch Exocytose von Neurotransmitter-haltigen synaptischer Vesikel vermittelten, und diese Vesikel müssen lokale endozytischen Recycling innerhalb der Nervenendigung unterziehen, um neuronale Kommunikation langfristig aufrecht zu erhalten. Angesichts der wesentlichen Rolle der synaptischen Übertragung im Gehirn, das Verständnis der molekularen Maschinerie, die synaptischen Vesikel-Zyklus ist eine wesentliche Grundlage für ein besseres Verständnis der zellulären Kommunikation als Ganzes darstellt. Unter Zellmodellsysteme, hat die chromaffinen Nebennierenzell einige der endgültige Einblick in die molekulare Maschinerie zugrunde liegenden synaptischen Vesikel-Recycling zur Verfügung gestellt. Exozytose, der letzte Schritt in der Neurotransmitterfreisetzung, wurde immens sucht und durch die Verwendung des chromaffinen Nebennierenzellen ^1,2 untersucht. In der Tat sind die meisten der molekularen Spieler, die die Bildung, Ausrichtung, Docking und Fusion von sekretorischen Granula instrumentieren wurden aufgrund der Anwendung von div identifizierterse Techniken in chromaffinen Zellen ^1. Darüber hinaus, indem sie eine Möglichkeit, sich für einzelne Vesikel-Auflösung der Proteinmaschinerie in Exozytose beteiligt zu ermöglichen, bleibt die chromaffinen Zellen ein leistungsfähiges Modell, um die Fragen der ^{Vesikel-Fusion-3-Adresse.}

Cell-Attached-Kapazitätsmessungen wurden zunächst bei der Lösung von Einzel Vesikelfusion während Exozytose ³ genutzt. Exocytose von Vesikeln so klein wie ca. 60 nm im Durchmesser, wurde gezeigt, dass durch die Zellmembran Admittanz Messungen mit der Patch-Clamp-Technik in der Zelle verbundene Konfiguration ^4-7 detektiert werden. Zulassung als Maß dafür, wie leicht eine Schaltung oder Vorrichtung ermöglicht, dass ein Strom fließen definiert; es ist das Inverse der Impedanz. Somit Admittanz Messungen liefern ein Verständnis der Membrankapazität. Dies wird durch den Einbau der Vesikelmembran in die Plasmamembran durchgeführt; Dieser Einbau zeigt Veränderungen der OberflächenBereich ^8. Jedes Schmelzen Vesikel bewirkt eine schrittweise Erhöhung der Membrankapazität ^9,10. Zusätzlich liefert diese Admittanzmessung die Membranleitfähigkeit und der Fusionsporen Leitfähigkeit während einer ^{Exozytose-Ereignis 3.} Wie diese Technik ein einzigartiges Werkzeug zur Identifizierung Single-Vesikel Kinetik während Exozytose vorgesehen ist, hat unser Labor vor kurzem angewendet dieses Konzept auf die Endozytose von einzelnen Vesikeln ^11,12 zu erkennen.

Unser Interesse gilt Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), die als Grundkomponente Housekeeping in vielen Zellen ¹³ und ein Hauptpfad für die synaptische Vesikel Endozytose in neuronalen Anschlüsse ^14,15 in Betracht gezogen wurde. CME ist bekannt, biologisch wichtig zu sein, bleiben jedoch seine Kinetik nicht gut verstanden aufgrund technischer Einschränkungen bei der Überwachung Singular endozytischen Veranstaltungen. Angesichts der Ähnlichkeiten in Exozytose Mechanismen zwischen chromaffinen Zellen und Neuronen ¹ ist es plausible, dass die Spaltung in chromaffinen Zellen Mechanismen kann wahrscheinlich synaptischen Vesikel Endozytose gelten in Neuronen. Die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen verwendet worden, um einzelne endozytischen Ereignisse zu überwachen und zu analysieren, die Spalt Kinetik, die die meisten Methoden nicht lösen können. In unserem Zell angebracht Aufnahmen wird eine Sinuswelle bei 20 kHz über die Haltepotential überlagert, und der Ausgangsstrom wird in Membranleitfähigkeit in einem Kanal und Membrankapazität in den anderen Kanal aus einem Zweiphasenverriegelungsverstärker ¹⁶ getrennt ^18. Aus den Veränderungen in der Membranleitfähigkeit und die Kapazität kann man die Kinetik der Spaltung Poren, die wahrscheinlich entspricht der röhrenförmigen Membran, die den Hals Internalisierungsfaktor Bläschen an der Plasmamembran-Vesikel vor der Abschnürung verbindet berechnen. Kollektiv, gibt uns diese Technik die Möglichkeit, die regulatorischen Mechanismen der Vesikel Spaltung während CME zu prüfen.

Protocol

HINWEIS: Das gesamte Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, wie von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Illinois in Chicago genehmigt. 1. Lösungen und Kultur Medien Vorbereitungen Halten Sie alle Lösungen bei -20 ° C für bis zu sechs Monate. Halten Sie das Kulturmedium bei 4 ° C für bis zu 3 Monate. Planen 100 ml Kulturmedium durch Mischen von 1 ml Pen-Strep-Lösung und 1 ml …

Representative Results

Die Zelllebensfähigkeit und die Qualität der Dichtung Gigaohm sind entscheidend für die Qualität der Cell-Attached-Kapazität Aufnahmen. Daher ist es wichtig, eine effektive und effiziente Zellkultur vor der elektrophysiologischen Ableitungen und typische lebensfähigen Zellen beschaffen sind in Abbildung 1 dargestellt. Üben und Zeit hilfreich, um eine Giga-Ohm Dichtung mit hoher Qualität sein. Wenn man kann deutlich sehen, Zellverformung, wenn der Patch-Pipette nähert sich der Zelle, wie in Schr…

Discussion

Cell-Attached-Kapazitätsmessungen erfordern mehrere wichtige Schritte, um Aufnahmen mit hoher Qualität erfolgreich zu erhalten: 1) lebensfähig und gesunden Zellen von Nebennieren hergestellt werden; 2) PDL Beschichtung der Deck; 3) Gigaohm Dichtung Bildung; 4) Geräuschpegel des Systems; und 5) Phasenkorrektur.

Für Tierchirurgie, ist eine potenziell Änderungen machen können, um den chirurgischen Ansatz, um am besten anpassen und Geschicklichkeit, um Schäden bei der Präparation zu ver…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm