Microscopie intravitale imagerie du foie suivante<em> Leishmania</em> Infection: Une évaluation de l'hémodynamique hépatiques
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Microscopie intravitale (IVM) est une technique d'imagerie optique puissant qui a rendu possible la visualisation, la surveillance et la quantification des différents événements biologiques en temps réel et dans les animaux vivants. Cette technologie a considérablement fait progresser notre compréhension des processus physiologiques et les phénomènes de micro-organismes pathogènes médiation dans les organes spécifiques.
Dans cette étude, IVM est appliquée sur le foie de la souris et les protocoles sont conçus pour l'image in vivo du système circulatoire du foie et mesurer des globules rouges (RBC) à vitesse vaisseaux hépatiques individuels. Pour visualiser les différents sous-types de navires qui caractérisent l'organe hépatique et effectuer des mesures de vitesse d'écoulement du sang, C57BL / 6 souris sont injectées par voie intraveineuse avec un réactif de plasma fluorescent qui marque le système vasculaire du foie associée. IVM permet in vivo, en temps réel, la mesure de la vitesse de RBC dans un récipient d'intérêt spécifique. L'établissement de cette méthode, il sera possible deenquêter sur l'hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et pathologiques. En fin de compte, cette méthodologie basée imagerie sera important pour l'étude de l'influence de L. infection donovani sur l'hémodynamique hépatiques.
Cette méthode peut être appliquée à d'autres modèles infectieuses et des organes de la souris et peut être étendu à une pré-clinique essais de l'effet d'un médicament sur l'inflammation par quantification de son effet sur le flux sanguin.
Introduction
Hémodynamique spécifiques d'organes sont des caractéristiques physiologiques importants de tout organe d'un mammifère. Des anomalies dans la circulation sanguine peuvent être la conséquence de l'inflammation et un signe de dysfonctionnement des organes 1. Ainsi, le flux sanguin organisation, la structure et la fonction apparaissent paramètres critiques pour l'analyse dans des conditions physiologiques et pathologiques. Les techniques qui ont été couramment utilisés pour l'analyse de la circulation sanguine dans un organe spécifique contiennent plusieurs limitations, y compris la limite de résolution de la technique elle-même (par exemple, l'imagerie Doppler du flux sanguin), la capacité de mesure du absolu flux sanguin seulement (volume de sang par unité servant un organe) (par exemple tomographie par cohérence optique) et la mesure du taux de changement de vitesse dans une population nombreuse et hétérogène de vaisseaux sanguins 2,3. Le système circulatoire du foie relie différents sous-types de navires qui sont hétérogènes dans leur taille, la structure et la fonction. Danscette étude, la microscopie intravitale (IVM) la technologie d'imagerie est appliquée pour évaluer l'hémodynamique du foie in vivo, en temps réel, à haute résolution et en parallèle pour découvrir les caractéristiques des vaisseaux sanguins individuels qui composent l'organe hépatique. Le développement récent de cette technique d'imagerie optique puissant permet au chercheur de collecter des données dynamique sur des animaux vivants à une résolution spatiale et temporelle. En permettant la visualisation directe et surveillance en temps réel des processus biologiques spécifiques et rapides in vivo, IVM offre une occasion unique pour le chercheur aux vaisseaux sanguins individuels d'image, et de mesurer et de quantifier la vitesse des globules rouges simples (RBC) dans un spécialement sélectionnés navire hépatique.
Dans cette étude, nous avons mis en œuvre la technique IVM dans le foie de souris pour étudier l'influence de l'infection de la souris par le parasite Leishmania hépatotrope sur l'hémodynamique du foie. L. donovaniest l'agent responsable de la leishmaniose viscérale, une maladie grave caractérisée par des réponses inflammatoires aiguës-on-chronique et une pathologie qui est présent dans de multiples organes, y compris la rate et le foie. Dans un modèle expérimental chez la souris de la leishmaniose viscérale, l'infection du foie est auto-résoudre alors que l'infection de la rate est progressive 4. Ces résultats d'infection Leishmania à l'égard des organes individuels ne sont pas encore complètement compris. Enquête de foie et la rate hémodynamique dans des conditions pathologiques va apporter un nouvel éclairage sur les interactions hôte-parasite et la pathogenèse de la maladie.
Notre système de modèle expérimental est basé sur l'exposition et l'imagerie du foie d'une souris anesthésiée qui a reçu une injection intraveineuse de colorants fluorescents spécifiques pour l'étiquetage de la intravasculature hépatique. Le foie est un organe favorable pour la microscopie intra-vital. Après avoir effectué un petit incision dans l'abdomen, le foie est extériorisé doucement et placé sur de la gaze humide, puis sur une lamelle avec l'objectif de réduire les artefacts de mouvement en raison de rythme cardiaque et la respiration. Le foie est ensuite placé à l'intérieur de la vue d'un objectif de microscope. Par rapport au noeud de la rate et de la lymphe qui nécessitent l'utilisation de deux microscopie photonique pour les études IVM, l'avantage du foie réside dans son architecture 3D homogène / anatomie qui permet l'utilisation d'un microscope confocal classique, avec une profondeur de pénétration maximum de environ 50 um, par imagerie par microscopie intravitale 5-8.
Cette étude décrit deux méthodes d'imagerie indépendantes pour la mesure quantitative de RBC vitesse et la vitesse du flux sanguin dans les vaisseaux sanguins individuels. Dans la première méthode, le débit sanguin hépatique est acquise en utilisant un mode bidimensionnel xy dans le temps. Les données de XYT en découlant sont analysés en utilisant le plugin MtrackJ dans le logiciel ImageJ libre, qui permet le suivi des individuel globules rouges dans le temps. Dans la seconde méthode, un seul vaisseau sanguin est sélectionné et son flux sanguin correspondant est analysée en utilisant le mode de balayage ligne de la confocal à balayage laser microscope acquisition rapide. Le navire d'intérêt est numérisé à haute fréquence le long de son axe central par le biais d'une ligne axiale. La vitesse d'écoulement du sang est ensuite quantifié sur la base de la différence de contraste entre les érythrocytes et le plasma sombres non marquées marqué par fluorescence. Les intensités de fluorescence des globules rouges et le plasma acquises le long de la ligne de balayage sont en fonction du temps pour obtenir des stries, dont les angles sont proportionnels aux vitesses d'un RBC individu.
Le but de cet article est de fournir une méthode simple et reproductible pour l'imagerie et mesure de la vitesse du flux sanguin dans les différents vaisseaux sanguins du foie et de mettre à disposition les outils de base pour l'exécution réussie de la chirurgie de la souris, l'IVM et des analyses quantitatives de la vitesse de globules rouges individuels. Tson approche permettra aux chercheurs d'acquérir de nouvelles connaissances dans la vitesse du sang dans des conditions pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le développement récent de la microscopie intravitale du foie de souris ouvre de nouvelles possibilités pour l'enquête de la réponse physiologique à l'infection in vivo et en temps réel 5,9,10. La circulation sanguine d'organes est un paramètre physiologique critique qui est souvent altérée dans de nombreuses maladies. Toutefois, le statut de l'hémodynamique du foie dans des conditions physiologiques et infectieuses reste un domaine mal exploré. Dans cette étude, les mét…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par l'INSERM, l'Université d'Aix-Marseille et un prix de développement de carrière à partir HFSPO obtenu par CL Forestier.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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