Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em> Leishmania</em> Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Microscopia intravitale (IVM) è un potente tecnica di imaging ottico che ha reso possibile la visualizzazione, il monitoraggio e la quantificazione di vari eventi biologici in tempo reale e di animali vivi. Questa tecnologia ha notevolmente avanzato la nostra comprensione dei processi fisiologici e fenomeni patogeni mediata in organi specifici.
In questo studio, IVM viene applicato al fegato mouse e protocolli sono progettati per immagini in vivo il sistema circolatorio del fegato e misurare globuli rossi (RBC) Velocità in singoli vasi epatici. Per visualizzare i diversi sottotipi dei vasi che caratterizzano l'organo epatica ed eseguire misure di velocità del flusso sanguigno, topi C57BL / 6 vengono iniettate per via endovenosa con un reagente fluorescente plasma che contrassegna la vascolarizzazione epatica associata. IVM consente in vivo, in tempo reale, la misurazione della velocità RBC in un recipiente specifico di interesse. Stabilire questa metodologia renderà possibileindagare l'emodinamica del fegato in condizioni fisiologiche e patologiche. In definitiva, questa metodologia di imaging basata sarà importante per studiare l'influenza di L. infezione donovani sull'emodinamica epatici.
Questo metodo può essere applicato ad altri modelli infettive e organi di topo e potrebbe essere estesa ai test preclinici di effetto di un farmaco su infiammazione quantificando il suo effetto sul flusso ematico.
Introduction
Emodinamica organo-specifiche sono importanti caratteristiche fisiologiche di qualsiasi organo dei mammiferi. Anomalie nel flusso di sangue possono essere la conseguenza di infiammazione e un segno di disfunzione d'organo 1. Così, il flusso di sangue organizzazione, la struttura e la funzione appaiono parametri critici per l'analisi in condizioni fisiologiche e patologiche. Le tecniche che sono comunemente impiegate per analizzare il flusso di sangue in un organo specifico contengono diverse limitazioni, tra cui il limite di risoluzione della tecnica stessa (es Doppler del flusso di sangue), la capacità di misurazione del flusso sanguigno assoluta solo (volume di sangue per unità che serve un organo) (ad esempio Optical Coherence Tomography) e la misurazione delle variazioni medie di velocità in un grande ed eterogenea popolazione di vasi sanguigni 2,3. Il sistema circolatorio del fegato collega diversi sottotipi vaso eterogenee nella loro dimensioni, struttura e funzione. Inquesto studio, la microscopia intravitale (IVM) tecnologia di imaging è applicata per valutare l'emodinamica fegato in vivo, in tempo reale, ad alta risoluzione e in parallelo per scoprire le caratteristiche dei singoli vasi sanguigni che compongono l'organo epatica. Il recente sviluppo di questa potente tecnica di imaging ottico consente al ricercatore di raccogliere dati dinamici sugli animali che vivono ad una risoluzione spaziale e temporale elevata. Consentendo la visualizzazione diretta e il monitoraggio in tempo reale dei processi biologici specifici e rapidi in vivo, IVM offre un'opportunità unica al ricercatore di vasi sanguigni immagine individuale, e misurare e quantificare la velocità di singole cellule rosse del sangue (globuli rossi) all'interno di un appositamente selezionati nave epatica.
In questo studio, abbiamo implementato la tecnica IVM nel fegato mouse per studiare l'influenza di infezione del mouse da parte del parassita Leishmania epatotropico sull'emodinamica fegato. L. donovaniè l'agente responsabile leishmaniosi viscerale, una malattia grave caratterizzata da risposte infiammatorie acute-on-cronica e una patologia che è presente in diversi organi, compreso la milza e nel fegato. In un modello sperimentale murino di leishmaniosi viscerale, l'infezione del fegato è auto-risolvere, mentre l'infezione della milza è progressiva 4. Questi risultati di infezione Leishmania rispetto ai singoli organi non sono ancora completamente compreso. Indagine su fegato e della milza emodinamica in condizioni patologiche getterà nuova luce sulle interazioni ospite-parassita e patogenesi della malattia.
Il nostro sistema di modello sperimentale si basa sull'esposizione di imaging e il fegato di un topo anestetizzato che ha ricevuto l'iniezione endovenosa di coloranti fluorescenti specifici per l'etichettatura del intravasculature epatica. Il fegato è un organo favorevole per la microscopia intra-vitale. Dopo aver eseguito un piccolo incision nell'addome, il fegato è delicatamente esternalizzato e collocato su una garza bagnata, poi su un vetrino con l'obiettivo di ridurre eventuali artefatti da movimento a causa di battito cardiaco e la respirazione. Il fegato è poi collocato all'interno della vista di una lente microscopio. Rispetto al nodo milza e linfa che richiedono l'uso di due fotoni microscopia per studi IVM, il vantaggio del fegato risiede nella sua architettura 3D omogeneo / anatomia che consente l'uso di un microscopio confocale convenzionale, con una profondità massima penetrazione circa 50 micron, per la microscopia intravitale immagini 5-8.
Questo studio descrive due metodi di imaging indipendenti per la misurazione quantitativa di RBC velocità e la velocità del flusso sanguigno nei singoli vasi sanguigni. Nel primo metodo, flusso ematico del fegato viene eseguita utilizzando una modalità bi-dimensionale xy nel tempo. I dati XYT risultanti vengono analizzati utilizzando il plugin MtrackJ nel software ImageJ gratuito, che consente la tracciabilità dei individUAL globuli rossi nel corso del tempo. Nel secondo metodo, un singolo vaso sanguigno è selezionato e il corrispondente flusso di sangue viene analizzato tramite la scansione di riga modalità veloce acquisizione del microscopio confocale a scansione laser. Il vaso di interesse viene scansionato ad alta frequenza lungo il suo asse centrale attraverso una linea assiale. La velocità del flusso di sangue viene poi quantificato in base alla differenza di contrasto tra senza etichetta eritrociti scuro e plasma fluorescente. Le intensità di fluorescenza di eritrociti e plasma acquisiti lungo la linea di scansione vengono rilevate in tempo per ottenere striature, i cui angoli sono proporzionali alle velocità di un individuo RBC.
L'obiettivo di questo articolo è di fornire un metodo semplice e riproducibile per l'imaging e misurando la velocità del flusso di sangue all'interno dei singoli vasi sanguigni del fegato e di mettere a disposizione gli strumenti di base per l'esecuzione di successo di chirurgia mouse IVM e analisi quantitative della velocità di singoli globuli rossi. Til suo approccio permetterà ai ricercatori di acquisire nuovi elementi in velocità del sangue in condizioni patologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il recente sviluppo della microscopia intravitale del fegato del topo apre nuove possibilità per la ricerca di risposta fisiologica alle infezioni in vivo e in tempo reale 5,9,10. Organo flusso di sangue è un parametro fisiologico fondamentale che viene spesso alterata in molte malattie. Tuttavia, lo stato di emodinamica del fegato in condizioni fisiologiche e infettive rimane una zona poco esplorata. In questo studio, metodi basati IVM, che in precedenza sono stati adattati per lo studio della mil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal INSERM, l'Università di Aix-Marseille e un premio di sviluppo della carriera da HFSPO ottenuto dalla CL Forestier.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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