Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em> Leishmania</em> Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik
Summary
This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.
Abstract
Intravitalmikroskopie (IVM) ist ein leistungsfähiges optisches bildgebendes Verfahren, das die Visualisierung, Überwachung und Quantifizierung der verschiedenen biologischen Ereignisse in Echtzeit und mit lebenden Tieren möglich gemacht hat. Diese Technologie hat sich unser Verständnis der physiologischen Prozesse und die Pathogen-vermittelte Phänomene in bestimmten Organen vorgerückt.
In dieser Studie IVM ist mit der Mausleber zur In-vivo das Kreislaufsystem der Leber angewendet und Protokolle sind so konzipiert und messen roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeit in einzelnen Lebergefäße. Um die verschiedenen Behälter Subtypen, der Leberorgan charakterisieren visualisieren und führen Blutströmungsgeschwindigkeit Messungen werden C57BL / 6-Mäusen intravenös mit einem fluoreszierenden Reagenz Plasma, die die Leber-assoziierten Gefäßen Etiketten injiziert. IVM ermöglicht in vivo, Echtzeit, Messung von RBC Geschwindigkeit in einem bestimmten Gefäß von Interesse. Gründung dieser Methode wird es möglich zu machen,Untersuchung der Leber-Hämodynamik unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Letztlich wird dies Imaging-basierte Methodik wichtig für die Untersuchung des Einflusses von L. sein donovani-Infektion auf die Leber-Hämodynamik.
Dieses Verfahren kann auf andere Infektionsmodelle und Maus Organe angewandt werden und könnte weiter ausgebaut vor, eine klinische Prüfung eines Arzneimittels Wirkung auf die Entzündung durch die Quantifizierung seiner Wirkung auf den Blutfluss werden.
Introduction
Organspezifische Hämodynamik sind wichtige physiologische Eigenschaften aller Säugetierorgans. Anomalien des Blutflusses können die Folge von Entzündungen und ein Zeichen von Organdysfunktion 1 sein. Somit Blutfluß Organisation, Struktur und Funktion werden als kritischer Parameter für die Analyse unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Die Techniken, die üblicherweise zur Analyse des Blutflusses in einem spezifischen Organ verwendet worden sind, enthalten mehrere Einschränkungen, einschließlich der Auflösungsgrenze des Verfahrens selbst (zB Doppler-Bildgebung des Blutflusses), die Fähigkeit zur Messung der absoluten Blutfluß nur (Volumen Blut pro Einheit dient ein Organ) (zB die optische Kohärenztomographie) und die Messung der durchschnittlichen Veränderungen in der Geschwindigkeit in einem großen und heterogenen Population von Blutgefäßen 2,3. Der Leber-Kreislauf-System verbindet verschiedene Gefäßtypen, die heterogene in ihrer Größe, Struktur und Funktion sind. ImDiese Studie, Intravitalmikroskopie (IVM) Bildgebungstechnik wird angewandt, um Leber-Hämodynamik in vivo zu bewerten, in Echtzeit mit hoher Auflösung und in parallelen, um die Eigenschaften der einzelnen Blutgefäße, die den Leberorgan umfassen aufzudecken. Die jüngste Entwicklung dieser leistungsfähigen optischen Bildgebungsverfahren ermöglicht es dem Forscher, um dynamische Daten an lebenden Tieren mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu sammeln. Dadurch, dass die direkte Visualisierung und Echtzeit-Überwachung von spezifischen und schnellen biologischen Prozesse in vivo, bietet IVM eine einzigartige Gelegenheit, den Forscher für Bild in einzelne Blutgefäße und zu messen und zu quantifizieren, die Geschwindigkeit der einzelnen roten Blutzellen (RBC) in einem speziell ausgewählten Lebergefäß.
In dieser Studie haben wir die IVM Technik in der Mausleber L. geführt, um den Einfluss der Maus Infektion mit dem hepatotropen Parasiten Leishmania auf Leber-Hämodynamik zu untersuchen. donovaniist die für die viszerale Leishmaniose, einer schweren Krankheit, die durch akut auf chronisch entzündliche Reaktionen und eine Pathologie, die in mehreren Organen, einschließlich der Milz und der Leber verantwortlich ist Mittel. In einem experimentellen Mausmodell von viszeraler Leishmaniose, ist die Leberinfektion ohne Behandlung während die Milz-Infektion ist progressiv. 4 Diese Ergebnisse Leishmania Infektion in Bezug auf einzelne Organe noch nicht vollständig verstanden. Untersuchung von Leber und Milz Hämodynamik unter pathologischen Bedingungen wird ein neues Licht auf Wirt-Parasit-Interaktionen und Krankheitsentstehung zu vergießen.
Unsere experimentelle Modellsystem ist auf Belichtung und Abbildung der Leber eines anästhesierten Maus, die eine intravenöse Injektion von spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen zur Markierung der Leber intravasculature erteilt hat. Die Leber ist ein Organ für die günstigen innerVitalMikroskopie. Nach der Durchführung einer kleinen incision in den Bauch, ist die Leber sanft externalisiert und auf nasser Gaze gelegt, dann auf einem Deckglas mit dem Ziel der Verringerung keine Bewegungsartefakte durch Herzschlag und Atmung. Die Leber wird dann innerhalb der Ansicht eines Mikroskopobjektivs angeordnet. Im Vergleich zu der Milz und Lymphknoten, die die Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie für IVM Studien erfordern, ist der Vorteil der Leber liegt in der homogenen 3D-Architektur / Anatomie, die für die Verwendung eines herkömmlichen konfokalen Mikroskop ermöglicht, mit einer maximalen Eindringtiefe etwa 50 & mgr; m für Intravitalmikroskopie Bildgebung 5-8.
Diese Studie beschreibt zwei unabhängige bildgebenden Verfahren für die quantitative Bestimmung von RBC Geschwindigkeit und Blutströmungsgeschwindigkeit in den einzelnen Blutgefäßen. Im ersten Verfahren wird Leberblutfluss unter Verwendung eines xy zweidimensionalen Modus über die Zeit erfasst. Die resultierenden xyt Daten werden mit dem MtrackJ Plugin im freien ImageJ Software, die für die Verfolgung der indivi ermöglicht analysiertual RBCs im Laufe der Zeit. Bei der zweiten Methode wird eine einzelne Blutgefäß ausgewählt und dessen entsprechende Durchblutung unter Verwendung der Zeilenabtastung schnelle Erfassungsmodus der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Das interessierende Gefäß wird bei hoher Frequenz entlang seiner zentralen Achse durch eine axiale Linie abgetastet. Die Blutflussgeschwindigkeit wird dann auf der Basis der Kontrastunterschied zwischen unmarkiertem dunklen Erythrozyten und fluoreszenzmarkierten Plasma quantifiziert. Die Fluoreszenzintensitäten der RBCs und Plasma entlang der Linie Abtastung erfasst werden gegen die Zeit aufgetragen, um Streifen zu erhalten, deren Winkel sind proportional zu den Geschwindigkeiten eines RBC.
Das Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und reproduzierbare Methode zur Bildgebung und Messung des Blutströmungsgeschwindigkeit in den einzelnen Blutgefäßen der Leber zu geben und für die erfolgreiche Performance der Maus Chirurgie, IVM und quantitative Analysen der Geschwindigkeit verfügbar zu machen die grundlegenden Werkzeuge einzelnen RBCs. Tsein Ansatz wird es den Forschern ermöglichen neue Einblicke in Blutgeschwindigkeit unter pathologischen Bedingungen zu gewinnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die jüngste Entwicklung der intravitalmikroskopische der Mausleber eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung der physiologischen Reaktion auf die Infektion in vivo und in Echtzeit 5,9,10. Organdurchblutung ist ein wichtiger physiologischer Parameter, der häufig bei vielen Erkrankungen verändert ist. Der Status der Leber-Hämodynamik unter physiologischen und ansteckende Bedingungen bleibt jedoch ein wenig erforscht Bereich. In dieser Studie IVM-basierte Verfahren, das zuvor für die Unte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der INSERM, der Universität Aix-Marseille und Career Development Award von HFSPO von CL Forestier erhalten unterstützt.
Materials
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| BSA-Alexa 647 | lifetechnologies | A34785 | |
| Dextran-FITC 500 mol wt | SIGMA | 46947 | |
| Ketamine | PanPharma | 20434 | |
| Xylazine | Bayer | KP07KEU | |
| Vetedine | Pharma Animal | 6869029 | |
| Cyanoacrylate liquid | Cyanolit | 5833300005 | |
| Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N°: 5013 | Molecular machines | 50103 | |
| Coverslip DiaPath 24×60 ep: 1.6 mm | DiaPath | 61061 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS-SP5 | |
| LAS-AF viewer | Leica software | Version 3.1.0 buid 8587 |
References
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