本文介绍一种非侵入性方法，通过细胞-基质阻抗和活细胞成像分析，以高时间分辨率连续量化细胞黏附与去黏附过程。这些方法可揭示由基质修饰引发的细胞黏附/去黏附过程的动力学特征，以及其与黏附依赖性信号事件之间的时间关系。
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本文内容
摘要
摘要
细胞-基质黏附在调控细胞形态和信号传导中起着关键作用。在多种疾病中，一些破坏细胞-基质黏附的刺激因素（例如，炎症过程中释放的髓过氧化物酶及其他基质修饰性氧化剂/酶）被认为可引发细胞功能、表型和存活能力的病理性改变。本文描述了如何利用细胞-基底阻抗技术和活细胞成像方法，以高时间分辨率、非侵入性的方式，准确量化由基质修饰（以内皮细胞和髓过氧化物酶作为病理生理性基质修饰刺激）所诱导的细胞黏附与去黏附的实时变化。xCELLigence细胞-基底阻抗系统通过测量生长于金微电极阵列上的细胞在细胞-基底界面处的电学阻抗，连续量化细胞-基质黏附面积。对时间延时微分干涉差（DIC）图像序列进行图像分析，可量化单个细胞投影面积随时间的变化，从而反映细胞-基质接触面积的动态改变。这两种技术均可准确量化细胞黏附与去黏附过程中的快速变化。基于微电极生物传感器阵列的细胞-基底阻抗检测为稳定、高通量的测量提供了平台。活细胞成像分析则进一步提供了细胞-基底阻抗测量所量化形态变化的本质与动态特征的额外细节。这些互补性方法为深入了解髓过氧化物酶催化的亚细胞水平细胞外基质成分的氧化修饰如何触发内皮细胞中细胞黏附、形态和信号传导的快速变化提供了宝贵的新视角。这些方法也可用于研究其他基质修饰性刺激以及相关黏附细胞（例如，上皮细胞）中细胞黏附动力学的响应。
引言
细胞与其周围细胞外基质之间稳定的黏附连接对于维持组织稳态至关重要。例如，血管中内皮细胞与内皮下基质的黏附在维持内皮层完整性及其作为调控性、半通透性血管屏障的稳态功能中起着关键作用1。肌动蛋白细胞骨架在细胞-基质黏附位点处与黏附性基质分子发生机械耦联，细胞-基质界面的黏附连接通过抵抗向心性的肌球蛋白张力，对细胞膜的位置起着重要的决定作用。能够改变细胞-基质黏附的胞外刺激必然改变细胞-基质界面处的力学平衡，这一变化会迅速被力学敏感的信号蛋白“感知”，从而引发“由外向内”的信号转导。细胞与其周围细胞外基质之间的这种相互作用在调控细胞形态、运动性、功能、增殖和存活中发挥关键作用2。
多种病理生理过程（胚胎发育、炎症、伤口修复和癌症转移）的特征是基质降解性氧化物和/或酶对黏附性基质底物进行动态重塑3,4。例如，在人类炎症性疾病中，血管内皮下黏附性基质蛋白（例如，纤连蛋白）被认为是被修饰或降解的主要靶标，这是由于白细胞来源的髓过氧化物酶（MPO）在炎症性血管疾病期间于内皮下层积聚，并局部产生活性氧化物（例如，次氯酸，HOCl）所致（图1）5-9。由MPO来源的氧化物及其他基质修饰性刺激所诱导的细胞-基质黏附变化，可能在多种病理过程中改变血管稳态方面发挥重要作用；例如，通过改变内皮细胞的信号传导、形态和存活能力，进而....
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方案
1. 内皮细胞常规培养
- 在明胶包被的组织培养瓶（用含0.1% w/v明胶的PBS在室温下孵育15分钟）中，使用EGM-2培养基（含EGM-2 BulletKit提供的5%胎牛血清、生长因子及厂家提供的所有补充成分，但不含氢化可的松）培养牛主动脉内皮细胞（第4–9代）。
- 当细胞接近汇合（以1:4比例传代后约3天）时，使用含0.05%（w/v）胰蛋白酶和0.02%（w/v）EDTA的PBS溶液在37 °C处理细胞以收集。待大部分细胞脱落后，加入完全EGM-2培养基以终止胰蛋白酶消化，随后离心（100 × g，5分钟）。
- 为研究准备细胞 从头合成 内皮细胞在纤连蛋白上的黏附（实验1：第2节），以及已在此基质上形成稳定黏附的内皮细胞的去黏附过程（实验2：第3节）。
- 用含1% w/v牛血清白蛋白（BSA）的无血清Medium 199洗涤收获的细胞一次，重新离心（100 × g，5 min）。
- 在含1%（w/v）BSA的无血清Medium 199培养基中重悬细胞，细胞密度为2.5 × 10⁶5 细胞/ml（细胞-基质阻抗测量）或 5 × 105 细胞/ml（活细胞成像分析），使用前于37 °C培养。
注意：细胞的黏附反应对温度差异极为敏感（例如， 由于对流效应，以下实验步骤中用于处理和培养细胞的所有设备和溶液均应保持在恒定的37 °C。
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结果
内皮细胞在髓过氧化物酶（MPO）介导的纤连蛋白氧化作用下从纤连蛋白上解离的实时定量分析（实验2）。 将内皮细胞悬液接种至天然（无MPO）纤连蛋白或含MPO的纤连蛋白表面后，细胞在2小时内达到最大附着和铺展，表现为细胞基质阻抗测量中的细胞指数值趋于平稳（图3A）。在按照实验1所述方案进行的实验中，若在细胞接种前已启动MPO介导的纤连蛋白氧化，则该初始附着与铺展阶段显著减弱（数据未显示；详见9）。一旦细胞在天然或含MPO的纤连蛋白上实现最大程度的黏附，通过MPO催化生成次氯酸（HOCl）所介导的靶向纤连蛋白氧化（由添加MPO共底物H2O2启动），会导致细胞-基质接触表面积迅速减少，这一现象可通过细胞基质阻抗检测（图3A,B）和活细胞成像（图3C；代表性微分干涉相差视频见Movie 1）观察到；而在无MPO存在时，加入H2O2后细胞指数或细胞面积的减少极小9.......
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讨论
细胞-基质黏附与去黏附过程可通过细胞-基底阻抗和活细胞成像分析在实时条件下以高时间分辨率进行精确量化。相较于终点法黏附分析（其时间分辨率较差），这些实时分析方法具有显著优势。通过高时间分辨率精确量化快速去黏附反应，此类分析可提供关键信息，揭示细胞对基质修饰的形态学响应的调控机制，以及这些响应如何影响黏附依赖性细胞信号转导过程，后者可通过相关的生物化学检测方法并行测定。例如，蛋白质印迹法）
在最近的研究中，这些方法被用于揭示髓过氧化物酶（MPO）介导的亚内皮基质氧化在触发内皮细胞去黏附过程中的新作用，并表明：（i）去黏附速率关键依赖于预先存在的肌动球蛋白收缩力（参见图3B和3C）；（ii）细胞-基质黏附的丧失驱动了多种重要黏附依赖性细胞信号通路的变化，包括Src依赖性的paxillin磷酸化和肌球蛋白轻链II的磷酸化9（见图1）。这些数据对于理解炎症反应过程中内皮功能和屏障完整性的调控具有重要意义，因为在这些病理条件下，亚内皮细胞外基质被认为是基质结合型MPO或其他活性氧化物来.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家健康与医学研究理事会（NHMRC）项目资助 568721（SRT）以及新南威尔士大学医学院研究基金（MDR）部分资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔金质细胞-基底阻抗微电极阵列 | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | 在xCELLigence系统上进行基于细胞检测的一次性使用板 |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | 非肌肉肌球蛋白II的选择性抑制剂 |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | 内皮细胞生长培养基试剂盒 |
| 纤维连接蛋白，冻干粉末 | Sigma | F-4759 | 来源于牛血浆 |
| Fluorodish 35 mm玻璃底细胞培养皿 | World Precision Instruments | FD35-100 | 带光学质量玻璃底的细胞培养皿，适用于成像 |
| 牛皮来源明胶 | Sigma | G9391 | 细胞培养基质 |
| Hank's平衡盐溶液 | Life Technologies | 14025076 | |
| 过氧化氢 | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | 无血清细胞培养基 |
| 甲硫氨酸 | Sigma | M9500 | 淬灭髓过氧化物酶生成的氯化性氧化剂 |
| 人多形核白细胞髓过氧化物酶 | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP仪器 / xCELLigence细胞基底阻抗系统 | ACEA Biosciences / Roche | 由RTCA分析仪、RTCA（多板）MP站和RTCA控制单元组成 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5%） | Gibco | 15400-054 |
参考文献
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J.....
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重印与许可
