Met behulp van Cell-substraat Impedantie en live cell imaging naar Real-time veranderingen in de cellulaire adhesie en De-adhesie geïnduceerd door Matrix Wijziging Meet
Summary
Hier presenteren we een protocol continu kwantificeren celadhesie en de adhesie processen met hoge tijdsresolutie op niet-invasieve wijze door cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze benaderingen onthullen de dynamiek van cel adhesie / de-adhesieprocessen getriggerd door matrixmodificatie en hun temporele relatie tot adhesie-afhankelijke signalering evenementen.
Abstract
Cel-matrix adhesie speelt een belangrijke rol in de controle celmorfologie en signalering. Stimuli die cel-matrix adhesie (bijvoorbeeld myeloperoxidase en andere matrix modificerende oxidanten / enzymen vrijkomen bij ontsteking) verstoren zijn betrokken bij het ontstaan van pathologische veranderingen in cellulaire functie fenotype en levensvatbaarheid in een aantal ziekten. Hier beschrijven we hoe cel-substraat impedantie en live cell imaging aanpak gemakkelijk kan worden gebruikt om nauwkeurig kwantificeren real-time veranderingen in celadhesie en de adhesie geïnduceerd door matrixmodificatie (met endotheelcellen en myeloperoxidase als pathofysiologische matrix modificerende stimulus) met hoge tijdsresolutie en op niet-invasieve wijze. De xCELLigence cel-substraat impedantie systeem kwantificeert continu het gebied van cel-matrix adhesie door meting van de elektrische impedantie in de mobiele substraatgrensvlak in cellen gekweekt op goud micro-elektrode arrays. Beeldanalyse van time-lapse differentiële interferentie contrast films kwantificeert veranderingen in het geprojecteerde gebied van afzonderlijke cellen in de tijd, die veranderingen in het gebied van cel-matrix contact. Beide technieken nauwkeurig te kwantificeren snelle veranderingen om cellulaire hechting en de-adhesieprocessen. Cel-substraat impedantie micro-elektrode arrays biosensor verschaft een platform voor robuuste, high-throughput metingen. Live cell imaging analyseert zorgen voor extra details met betrekking tot de aard en de dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door cel-substraat impedantie metingen. Deze aanvullende benaderingen leveren waardevolle nieuwe inzichten in hoe-myeloperoxidase- gekatalyseerde oxidatie van subcellulaire extracellulaire matrix componenten triggers snelle veranderingen in de cel adhesie, morfologie en signalering in endotheelcellen. Deze benaderingen zijn ook voor het bestuderen van cellulaire adhesie dynamiek in reactie op andere matrix modificerende stimuli en aanverwante hechtende cellen (bijvoorbeeld epitheelcellen).
Introduction
Stabiele lijm contacten tussen cellen en de omringende extracellulaire matrix vereist onderhoud weefsel homeostase. Bijvoorbeeld endotheelcel adhesie aan de subendotheliale matrix bloedvaten speelt een cruciale rol bij het handhaven van de integriteit van de endotheliale laag en de homeostatische functie als regulerende, halfdoorlaatbare barrière vasculaire 1. Het actine cytoskelet is mechanisch gekoppeld met matrix moleculen op plaatsen van cel-matrix adhesie en hechtende contacten op de cel-matrix-interface lijm spelen een belangrijke rol bij het bepalen van de positie van het celmembraan door weerstand centraal gerichte actomyosine trekkrachten. Extracellulaire stimuli die cel-matrix adhesie veranderen nood- evenwicht van krachten de cel-matrix-interface, een gebeurtenis die snel veranderen "gevoeld" door mechanisch-gevoelige signaaleiwitten, waardoor de transductie van "outside-in signalering". Deze cross-talk betsen cellen en de omringende extracellulaire matrix speelt een belangrijke rol in de controle celvorm, beweeglijkheid, functionaliteit, proliferatie en overleving 2.
Diverse pathofysiologische processen (embryonale ontwikkeling, ontsteking, wondheling en kanker metastase) worden gekenmerkt door dynamische remodelleringvan klevende matrix substraten matrix- afbrekende oxidanten en / of enzymen 3,4. Bijvoorbeeld, zelfklevend subendotheliale matrixeiwitten bloedvaten (bijvoorbeeld fibronectine) zijn geïmpliceerd als belangrijke doelwitten voor modificatie of afbraak in het inflammatoire ziekten als gevolg van de lokale productie van reactieve oxidanten (bijvoorbeeld, hypochloorzuur, HOCl) van de leukocyt afgeleide enzym myeloperoxidase (MPO), die in inflammatoire vaatziekten (figuur 1) 5-9 accumuleert in het subendotheel. Veranderingen in cel-matrix adhesie geïnduceerd door MPO-afgeleide oxidanten en andere matrix modificerende stimuli likEly belangrijke rol spelen bij veranderende vasculaire homeostase bij verschillende pathologische processen, bijvoorbeeld door verandering van endotheelcellen signalering, morfologie en levensvatbaarheid, waardoor verstoort endotheelfunctie en integriteit. Echter, de morfologische en celsignalen reacties van hechtende cellen aan de extracellulaire matrix wijzigingen alleen begint te worden begrepen.
Om te begrijpen hoe matrix wijzigingen rijden veranderingen in cel adhesie dynamiek en adhesie-afhankelijke cel signaalwegen, zijn technieken die nodig zijn dat veranderingen in de cel-matrix adhesie in real time nauwkeurig te kwantificeren, met een hoge temporele resolutie. We beschrijven hier complementair cel-substraat impedantie en live cell imaging technieken die aan deze criteria voldoen en een platform celadhesie en de adhesie processen kwantificeren op niet-invasieve wijze.
We laten zien hoe deze cel-substraat impedantie en live cell imaging voorkomendpijn kan gemakkelijk worden toegepast om (i) controleren de dynamiek van celhechting en spreiding (dwz de novo celadhesie) op natieve en gemodificeerde matrix substraten en (ii) de dynamica van cel-matrix onthechting meten (dwz de wrijvingscoëfficiënt ) van hechtende cellen blootgesteld aan matrix modificerende stimuli. De xCELLigence cel-substraat impedantie biosensor systeem zorgt voor een continue meting van de oppervlakte van de cel-matrix contact door het kwantificeren van elektrische impedantie aan het oppervlak van 96-wells gouden micro-elektrode arrays en spreekt deze elektrische impedantie metingen als 'cell-index', een dimensieloze waarde die is grotendeels evenredig met het oppervlak van cel-substraat contact 10 (figuur 2), terwijl ook gevoelig voor veranderingen in de gemiddelde afstand tussen de (isolerende) celmembraan en het elektrodeoppervlak 11. Een verdere toename van de cel-index waarden wordt ook bereikt bij de oprichting van strakke cel-cel contacten that beperken paracellulair stroom, 11 omstandigheden die niet binnen de in deze studie beschreven experimenten doen prevaleren. Meting van het geprojecteerde gebied van individuele cellen in de tijd door beeldanalyse van time-lapse differentieel interferentie contrast (DIC) films biedt een aanvullende maatregel van veranderingen op het gebied van cel-substraat contact en geeft aanvullende informatie over de precieze aard en dynamiek van de morfologische veranderingen gekwantificeerd door de cel-substraat impedantie benadering.
Met name de toepassing van deze benaderingen volgen hoe MPO-gemedieerde oxidatie kleefmiddel subendotheliale matrix proteïnen (bijvoorbeeld fibronectine) (i) vermindert het de novo hechting van zwevende endotheelcellen op gezuiverde fibronectine en (ii) activeert cel-matrix de We beschrijven -adhesion in endotheelcellen vastgelegde hechting aan fibronectine. Door het uitvoeren van parallelle celsignalering analyseert de tijd met behulp van relevante biochemical assays (bijvoorbeeld Western blotting), de temporele en causale verbanden tussen adhesie / de-adhesie processen en bijbehorende veranderingen in adhesie-afhankelijke signaaltransductie gebeurtenissen kunnen worden bepaald.
Deze benaderingen zijn onlangs gebruikt om aan te tonen dat extracellulaire matrix oxidatie gekatalyseerd door subendotheliale afzettingen van MPO veroorzaakt een snelle verlies in cel-matrix adhesie van endotheelcellen die wordt aangedreven door bestaande actomyosine contractiele krachten 9. Belangrijk doordat de tijdsrelatie tussen veranderingen in zowel celadhesie en adhesie-afhankelijke signaaltransductie te bepalen deze benaderingen vastgesteld MPO geïnduceerde matrixmodificatie en de cellulaire adhesie triggers wijziging van belangrijke adhesie-afhankelijke signaaltransductie wegen waaronder Src kinase paxillin afhankelijke fosforylering en myosine lichte keten II fosforylering (figuur 1) 9. Deze wijze van redox-afhankelijke signalering, invOlving de activatie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen extracellulair oxidatieve reacties die cel-matrix adhesie te verstoren, is een nieuwe werkwijze celsignalen genoemd "outside-in redox signalling" (figuur 1) 9.
In het algemeen moeten deze complementaire cel-substraat impedantie biosensor en live cell imaging aanpak waardevol in onthullen hoe verschillende matrix modificerende stimuli of agenten rijden veranderingen in celadhesie dynamiek, morfologie en signalering binnen verschillende hechtende celtypen onder uiteenlopende experimentele instellingen.
Het volgende protocol beschrijft hoe u de impact van MPO-gemedieerde matrix oxidatie op de novo endotheliale cel adhesie (Experiment 1) en endotheelcellen de-adhesie (Experiment 2) processen te kwantificeren. MPO bindt gretig aan fibronectine en andere lijm subendotheliale extracellulaire matrix eiwitten en onses waterstofperoxide (H 2 O 2) in chloride-ionen (Cl -) omzetten in de zeer reactieve chloreringsmiddel oxidatiemiddel hypochloorzuur (HOCl), die plaatselijk tast deze matrixeiwitten en verstoort de cel hechting (figuur 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cel-matrix adhesie en de-adhesieprocessen nauwkeurig kan worden gekwantificeerd in real time met een hoge temporele resolutie met behulp van cel-substraat impedantie en live cell imaging analyses. Deze real-time benaderingen bieden een groot voordeel ten opzichte van end-point analyses van cel adhesie, die arme temporele resolutie bieden. Door het nauwkeurig kwantificeren snelle de-hechting reacties met een hoge temporele resolutie, kunnen deze analyses kritisch inzicht in verschaffen hoe morfologische reacties op matri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
