Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar continuamente os processos de adesão celular e de aderência com alta resolução temporal de uma forma não-invasiva por impedância célula-substrato e imagens de células vivas analisa. Estas abordagens revelar a dinâmica dos processos de adesão célula / de aderência desencadeadas por modificação da matriz e a sua relação temporal com os eventos de sinalização dependentes de adesão.

Abstract

A adesão celular de matriz desempenha um papel chave no controlo da morfologia das células e sinalização. Os estímulos que perturbam a adesão de células-matriz (por exemplo, mieloperoxidase e outras oxidantes modificadores da matriz / enzimas libertados durante a inflamação) estão implicados em provocar alterações patológicas em função celular, fenótipo e viabilidade de uma série de doenças. Aqui, descrevemos como impedância célula-substrato e abordagens imagens de células vivas podem ser facilmente usadas para quantificar com precisão as alterações em tempo real na adesão celular e de-adesão induzida pela modificação da matriz (usando células endoteliais e myeloperoxidase como um estímulo de modificação da matriz fisiopatológico) com alta resolução temporal e de um modo não-invasivo. O sistema da impedância célula-substrato xCELLigence quantifica de forma contínua a área de adesão célula-matriz através da medição da impedância eléctrica na interface célula-substrato em células cultivadas em matrizes de microeléctrodos de ouro. A análise das imagens de time-lapse differencial filmes de contraste de interferência quantifica mudanças na área projectada de células individuais ao longo do tempo, que representa as alterações na área de contacto célula-matriz. Ambas as técnicas quantificar com precisão as rápidas mudanças nos processos de adesão celular e de aderência. Impedância Cell-substrato em matrizes de microeletrodos biossensores fornece uma plataforma para medições robusto, de alta taxa de transferência. Imagens de células vivas analisa fornecer detalhes adicionais sobre a natureza ea dinâmica das alterações morfológicas quantificados por medidas de impedância célula-substrato. Estas abordagens complementares fornecer valiosos novos insights sobre como catalisada por mieloperoxidase modificação oxidativa da subcelulares componentes da matriz extracelular desencadeia mudanças rápidas na adesão celular, morfologia e sinalização em células endoteliais. Estas abordagens são aplicáveis ​​também para o estudo da dinâmica de adesão celular em resposta a outros estímulos de modificação da matriz e em células aderentes relacionados (por exemplo, células epiteliais).

Introduction

Contactos adesivas estáveis ​​entre as células e a sua matriz extracelular circundante são necessários para a manutenção da homeostase dos tecidos. Por exemplo, a adesão de células endoteliais com a matriz subendotelial em vasos sanguíneos desempenha um papel crítico na manutenção da integridade da camada endotelial e sua função homeostática como uma barreira vascular reguladora, semi-permeável ^1. O citoesqueleto de actina é acoplado mecanicamente ao adesivo moléculas de matriz em locais de adesão célula-matriz e contactos adesivas na interface de célula-matriz desempenham um papel importante na determinação da posição da membrana celular por resistir forças de tracção dirigidas actomiosina centralmente. Estímulos extracelulares que alteram a adesão célula-matriz necessariamente alterar o equilíbrio de forças na interface de células-matriz, um evento que é rapidamente "detectado" por proteínas de sinalização sensível ao mecano, resultando na transdução de "fora-de sinalização". Esta aposta cross-talkween células e a sua matriz extracelular circundante desempenha um papel chave no controlo da forma celular, motilidade, função, proliferação e sobrevivência ^2.

Processos patofisiológicos diversas (desenvolvimento embrionário, inflamação, reparação de feridas e metástases do cancro) são caracterizadas por remodelação dinâmica de substratos de matriz adesiva por oxidantes e / ou enzimas que degradam a matriz ^3,4. Por exemplo, as proteínas da matriz adesiva subendoteliais nos vasos sanguíneos (por exemplo, fibronectina) estão implicados como importantes alvos para a alteração ou degradação em doenças inflamatórias humanas devido à produção localizada de oxidantes reactivos (por exemplo, ácido hipocloroso, HOCl) pela enzima derivada de leucócitos mieloperoxidase (MPO), que se acumula no interior da sub-endotélio vascular durante a doença inflamatória (Figura 1) ^5-9. As alterações na adesão célula-matriz induzidas pelos oxidantes derivados de MPO e outros estímulos de modificação de matriz são likely a desempenhar papéis importantes na modificação da homeostase vascular durante um variedade de processos patológicos, por exemplo, alterando a sinalização celular endotelial, a morfologia e a viabilidade, o que por sua vez perturba a função endotelial e a integridade da barreira. No entanto, as respostas celulares e morfológicas de sinalização de células aderentes às modificações da matriz extracelular só agora começam a ser entendido.

Para entender como modificações da matriz conduzir alterações na dinâmica de adesão celular e as vias de sinalização celulares dependentes de adesão, são necessárias técnicas que quantificar com precisão alterações na adesão célula-matriz em tempo real, com elevada resolução temporal. Aqui, descrevemos impedância célula-substrato complementar e técnicas de imagens de células vivas que preenchem estes critérios e proporcionar uma plataforma para quantificar a adesão celular e processos de aderência de uma forma não-invasiva.

Nós mostramos como estes impedância célula-substrato e apro imagens de células vivasdores podem ser prontamente utilizados para (i) monitorizar a dinâmica de adesão e espalhamento (ou seja, de novo, a adesão de células) em substratos de matriz nativos e modificados e (ii) para medir a dinâmica de desprendimento de células-matriz (isto é, de aderência ) por células aderentes expostas aos estímulos de modificação de matriz. O sistema xCELLigence célula-substrato impedância biosensor fornece uma medição contínua da área de contato de matriz celular por meio da quantificação de impedância elétrica na superfície de 96 poços matrizes de microeletrodos de ouro e expressa essas medidas de impedância elétrica como "índice de célula ', um valor sem dimensão, que é em grande parte proporcional à área de contacto célula-substrato ¹⁰ (Figura 2), sendo simultaneamente sensíveis a alterações na distância média entre o (isolante) da membrana celular e a superfície do eléctrodo ^11. Um aumento adicional nos valores de índice de célula também é conseguido mediante a formação de apertado contactos célula-célula that restringir o fluxo de corrente paracelular, ¹¹ condições que não prevalecem dentro das experiências descritas neste estudo. Medição da área projetada de células individuais ao longo do tempo por análise de imagem de time-lapse contraste de interferência diferencial (DIC) filmes fornece uma medida complementar de mudanças na área de contato célula-substrato e fornece informações adicionais sobre a natureza precisa e dinâmica do alterações morfológicas quantificados pela abordagem impedância célula-substrato.

Especificamente, descreve-se a aplicação destas abordagens para controlar a forma como a oxidação das proteínas da matriz subendotelial adesivas (por exemplo, fibronectina) (i) MPO mediada reduz a aderência de novo de células endoteliais em suspensão em fibronectina purificada e (ii) desencadeia célula-matriz de -adhesion em células endoteliais com a adesão estabelecida com fibronectina. Através da realização de sinalização celular paralelo análises ao longo do tempo usando biochem relevanteensaios iCal (por exemplo, transferência de Western), as relações temporais e causais entre processos de adesão / de-adesão e suas alterações em células de eventos de sinalização dependentes de adesão pode ser determinada.

Estas abordagens foram recentemente utilizados para demonstrar que a oxidação da matriz extracelular catalisada por depósitos subendoteliais de MPO provoca uma rápida perda de aderência célula-matriz de células endoteliais que é accionado por pré-existente forças contrácteis ⁹ actomiosina. É importante notar que, permitindo o relacionamento temporal entre mudanças tanto na adesão celular e adesão celular dependente de sinalização a ser determinado, estas abordagens identificaram que a modificação da matriz induzida por MPO e de aderência celular provoca alterações em vias de sinalização celulares dependentes de adesão importantes, incluindo Src cinase fosforilação dependente de paxilina e cadeia leve da miosina II fosforilação (Figura 1) ^9. Este modo de sinalização dependentes de redox, involving a activação dos acontecimentos de sinalização intracelular através de reacções oxidativas extracelulares que perturbam a adesão de células-matriz, representa um novo modo de sinalização celular denominado "fora-de sinalização redox" (Figura 1) ^9.

Em geral, estes complementar biossensor impedância célula-substrato e abordagens imagem de células vivas deve ser valioso em revelar como diferentes estímulos ou agentes de modificação da matriz conduzir alterações na dinâmica de adesão celular, a morfologia e a sinalização dentro de diferentes tipos de células-sujeitas a uma grande variedade de aderentes configurações experimentais.

O protocolo a seguir descreve como quantificar o impacto da oxidação matriz MPO mediada no de novo a adesão das células endoteliais (Experimento 1) e célula processos de-adesão endotelial (2 Experiment). MPO liga avidamente a fibronectina e outras proteínas da matriz extracelular subendoteliais adesivas e noses de peróxido de hidrogénio (H ₂ O _2), para converter os iões cloreto (Cl ^-) para a cloração oxidante altamente reactivo do ácido hipocloroso (HOCl), que reage localmente com estas proteínas de matriz e interrompe as suas propriedades de adesão celular (Figura 1) ^{8,9, 12.}

Protocol

1. Geral endotelial Cultura de Células Culturas de células endoteliais de aorta bovina (passagens 4-9) em frascos de cultura de tecidos revestidos com gelatina (revestimento de superfície de cultura de tecido com 0,1% w / v de gelatina em PBS à temperatura ambiente durante 15 min) em EGM-2 media (com EGM-2 bala kit contendo 5% de soro fetal bovino, factores de crescimento e todos os suplementos fornecidos pelo fabricante, com excepção para a hidrocortisona). Quando as células estão perto con…

Representative Results

Quantificação em tempo real da célula de-adesão endotelial de fibronectina em resposta à oxidação fibronectina MPO-mediada (Experimento 2). A semeadura de suspensões de células endoteliais para nativa (MPO livre) fibronectina ou MPO-rolamento resultados fibronectina na fixação das células máxima e se espalhando dentro de 2 horas, tal como avaliado por um plateauing de valores de índice de células na medições de impedância do substrato celular (Figura 3A). Esta fase ini…

Discussion

Adesão de células-matriz e de processos de adesão pode ser quantificada de forma precisa e em tempo real com alta resolução temporal utilizando impedância célula-substrato e analisa imagens de células vivas. Estas abordagens em tempo real fornecem uma grande vantagem sobre as análises de ponto final de adesão celular, que fornecem baixa resolução temporal. Ao quantificar com precisão as respostas de-adesão rápidas com alta resolução temporal, estas análises podem fornecer uma visão crítica sobre como…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array	ACEA Biosciences / Roche	E-Plate 96	single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system
blebbistatin	Sigma	B0560	selective inhibitor of non-muscle myosin-II
Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved	Lonza	BW-6001
Bovine serum albumin	Sigma	05470
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	endothelial cell growth media kit
Fibronectin, lyophilized powder	Sigma	F-4759	from bovine plasma
Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish	World Precision Instruments	FD35-100	Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging
Gelatin from bovine skin	Sigma	G9391	cell culture substratum
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025076
Hydrogen peroxide	Merck	107298
Medium-199	Life Technologies	11150-059	serum-free cell media
Methionine	Sigma	M9500	quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase
Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes	Millipore	475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system	ACEA Biosciences / Roche	–	Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit
Trypsin-EDTA (0.5%)	Gibco	15400-054