שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת ברציפות תהליכי הידבקות התא ודה-הידבקות עם רזולוציה גבוהה זמנית באופן בלתי פולשני על ידי עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה חושפות את הדינמיקה של תהליכי הדבקת תא / דה-הידבקות מופעלים על ידי שינוי מטריצה והיחסים הזמני שלהם לאירועי איתות הידבקות תלויה.
Abstract
הידבקות תא-מטריצה ממלאת תפקיד מרכזי בשליטה מורפולוגיה של תאים ואיתות. גירויים המשבשים הידבקות תא-מטריצה (למשל, Myeloperoxidase וחמצון שינוי מטריצה אחר / אנזימים שפורסמו במהלך דלקת) הם מעורבים במפעילים שינויים פתולוגיים בתפקוד התאי, פנוטיפ וכדאיות במספר המחלות. כאן, אנו מתארים כיצד עכבת תא-מצע וגישות הדמיה תא חיות יכולים להיות מועסקות בקלות לכמת במדויק את השינויים בזמן אמת בהידבקות תא ודה-הידבקות הנגרמת על ידי שינוי מטריצה (תוך שימוש בתאי האנדותל וMyeloperoxidase כגירוי שינוי המטריצה pathophysiological) עם רזולוציה גבוהה זמנית ובאופן לא פולשני. מערכת עכבת תא-מצע xCELLigence רציפות מכמתת את האזור של הידבקות תא-מטריצה על ידי מדידת העכבה החשמלית בממשק שהתא-המצע בתאים שגודלו במערכי microelectrode זהב. ניתוח תמונה של זמן לשגות בידולtial סרטי ניגוד להפרעות מכמת שינויים באזור המוקרן של תאים בודדים לאורך זמן, המייצג את השינויים באזור מגע התא-מטריקס. שני טכניקות מדויקים לכמת שינויים מהירים לתהליכי הדבקה סלולרית ודה-הידבקות. עכבת תא-מצע על מערכי biosensor microelectrode מספקת פלטפורמה למדידות תפוקה גבוהה חזקה,. הדמיה תא חי מנתחת לספק פירוט נוסף לגבי האופי והדינמיקה של השינויים מורפולוגיים לכמת ידי מדידות עכבת תא-מצע. גישות משלימות אלה מספקות תובנות חדשות חשובות איך שינוי חמצוני-זרז Myeloperoxidase של רכיבי מטריצה תאיים subcellular מפעיל שינויים מהירים בהידבקות תא, מורפולוגיה ואיתות בתאי האנדותל. גישות אלה חלות גם על לימוד דינמיקת הידבקות סלולרית בתגובה לגירויי שינוי מטריצה אחרות ובתאים הקשורים חסיד (לדוגמא, תאי אפיתל).
Introduction
אנשי קשר דבק יציבים בין תאים והחוץ-התאי המקיף אותם נדרשים לשמירה על הומאוסטזיס רקמות. לדוגמא, הדבקת תא האנדותל למטריצת subendothelial בכלי דם משחקת תפקיד קריטי בשמירה על שלמות שכבת האנדותל ותפקודו homeostatic כחסם רגולטורים, חדיר למחצה כלי דם 1. Cytoskeleton אקטין מצמיד מכאנית לדבק מולקולות מטריצה באתרים של הידבקות התא-מטריקס ואנשי קשר דבק בממשק שהתא-המטריצה לשחק תפקיד חשוב בקביעת המיקום של קרום התא על ידי התנגדות כוחות המתיחה actomyosin מרכזית מכוונות. גירויים תאיים המשנים הידבקות תא-מטריצה בהכרח לשנות את מאזן כוחות בממשק שהתא-מטריקס, אירוע שהוא במהירות "חשו" על ידי חלבוני איתות מכאניים רגישה, וכתוצאה מכך התמרה של "מחוץ-באיתות". הימור הצטלבות זותאי Ween ומטריצת החוץ תאי המקיפה אותם ממלאות תפקיד מרכזי בשליטה צורת תא, תנועתיות, פונקציה, שגשוג והישרדות 2.
תהליכים מגוונים פיתו-פיסיולוגי (התפתחות עוברית, דלקת, תיקון פצע וגרורות סרטן) מתאפיינים בעיצוב מחדש דינמי של מצעי מטריצת דבק על ידי חמצון מטריצה-משפילה ו / או אנזימים 3,4. לדוגמא, דבק חלבוני מטריצת subendothelial בכלי דם (למשל, פיברונקטין) הם מעורבים כמטרות עיקריות לשינוי או השפלה במחלות דלקתיות אדם בשל הייצור המקומי של חמצון תגובתי (למשל, חומצת hypochlorous, HOCl) על ידי האנזים המופק מויקוציטים Myeloperoxidase (MPO), אשר מצטבר בתוך subendothelium במהלך מחלת כלי דם דלקתית (איור 1) 5-9. שינויים בהידבקות תא-מטריצה הנגרמים על ידי חמצון נגזר MPO וגירויים שינוי מטריצה אחרים ליקאיליי למלא תפקידים חשובים בשינוי הומאוסטזיס כלי דם במהלך מגוון רחב של תהליכים פתולוגיים; למשל, על ידי שינוי איתות תא האנדותל, מורפולוגיה וכדאיות, אשר בתורו מדאיגה את תפקוד האנדותל ושלמות מחסום. עם זאת, תגובות האיתות מורפולוגיים ותא של תאים חסיד לשינויים מטריצה תאיים הן רק מתחילות להיות מובנות.
כדי להבין כיצד שינויי מטריצה לנהוג שינויים בדינמיקת הידבקות תא ומסלולי תא איתות הידבקות תלויה, טכניקות נדרשות במדויק לכמת שינויים בהידבקות התא-מטריקס בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה זמנית. כאן אנו מתארים עכבת תא-מצע משלים וטכניקות הדמיה תא חיות שעומדות בקריטריונים הללו ולספק פלטפורמה לכמת הידבקות תא ותהליכי דה-הידבקות באופן לא פולשני.
אנו מראים כיצד עכבת תא-מצע אלה וappro הדמיה תא החיכאבים יכולים להיות מועסקים בקלות ל( i) לפקח על הדינמיקה של קובץ מצורף תא והפצה (כלומר, דה נובו הידבקות תא) על גבי מצעי מטריצת ילידים שונה ו( ii) כדי למדוד את הדינמיקה של ניתוק תא-מטריצה (כלומר, דה-הידבקות ) על ידי תאים חסיד החשופים לגירויי שינוי מטריצה. מערכת biosensor עכבת תא-מצע xCELLigence מספקת מדידה רציפה של אזור מגע תא-מטריצה על ידי כימותי עכבה חשמלית על פני השטח של מערכי microelectrode זהב 96-היטב ומבטאת מדידות עכבה חשמליות אלה, כמו "מדד תא ', ערך ממדים ש במידה רבה יחסי לאזור של תא-מצע ליצירת קשר 10 (איור 2), בעוד גם להיות רגישים לשינויים במרחק הממוצע בין קרום התא (בידוד) ופני האלקטרודה 11. עלייה נוספת בערכי מדד תא השיגה גם על היווצרות tha קשר תאי תאים הצמודt להגביל זרם paracellular, 11 תנאים שאינם גוברים בתוך הניסויים שתוארו במחקר זה. מדידה של האזור המוקרן של תאים בודדים לאורך זמן על ידי ניתוח תמונה של התערבות ההפרש לעומת זאת זמן לשגות סרטים (DIC) מספקת מידה משלימה של שינויים בתחום קשר עם תא-מצע ומספק מידע נוסף לגבי האופי והדינמיקה המדויק של שינויים מורפולוגיים לכמת ידי גישת עכבת תא-מצע.
באופן ספציפי, אנו מתארים את יישום גישות אלה כדי לפקח איך תיווך MPO חמצון של חלבוני מטריצת subendothelial דבק (למשל, פיברונקטין) (i) מפחית את הידבקות דה נובו של תאי האנדותל הושעו על פיברונקטין מטוהר ו( ii) מפעיל דה התא-מטריקס -adhesion בתאי האנדותל עם הידבקות הוקמה על פיברונקטין. על ידי ביצוע איתות תא מקביל מנתח לאורך זמן באמצעות Biochem הרלוונטימבחני iCal (למשל, מערבי סופג), יחסי זמן וסיבתי בין תהליכי ההדבקה / דה-הידבקות ושינויים הקשורים באירועי תא איתות הידבקות תלויה ניתן לקבוע.
גישות אלה שמשו לאחרונה על מנת להוכיח כי חמצון חוץ-תאי זרז ידי הפקדות subendothelial של MPO מפעיל אובדן מהיר בהידבקות תא-מטריצה של תאי האנדותל המונעת על ידי כוחות התכווצות actomyosin קיים מראש 9. חשוב לציין, בכך שיאפשר קשר הזמני בין שינויים בשתי הידבקות התא ותא הידבקות תלויה איתות שייקבע, גישות אלה זיהו כי שינוי מטריצה מושרה MPO ודה-הידבקות סלולרית מפעיל שינויים במסלולי הידבקות תלויה חשובים תא איתות כוללים קינאז Src שרשרת זירחון paxillin + התלוי ושרירן אור II זרחון (איור 1) 9. מצב זה של איתות חיזור תלוי, involving ההפעלה של אירועי איתות תאיים על ידי תגובות חמצון תאיים המשבשות הידבקות התא-מטריקס, מייצג מצב רומן של תא איתות מכונה "מחוץ-באיתות חיזור" (איור 1) 9.
באופן כללי, biosensor אלה משלימים עכבת תא-מצע וגישות הדמיה תא חיות צריכים להיות בעל ערך בחשיפה כמה שונה גירויי שינוי מטריצה או סוכנים לנהוג שינויים בדינמיקת הידבקות תא, מורפולוגיה ואיתות בתוך תא-סוגים שונים חסיד כפופים למגוון רחב של הגדרות ניסיוניות.
הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לכמת את ההשפעה של חמצון מטריצת תיווך MPO על דה נובו הידבקות אנדותל תא (ניסוי 1) ודה-הידבקות אנדותל תא (ניסוי 2) תהליכים. MPO נקשר בשקיקה לפיברונקטין וחלבוני subendothelial דבק אחרים חוץ-תאיים וes מי חמצן (H 2 O 2) להמיר יוני כלוריד (Cl -) לחומצה מאוד תגובתי חמצון chlorinating hypochlorous (HOCl), אשר מגיבה באופן מקומי עם חלבוני מטריצה אלה ומשבשים מאפיינים דבקים הסלולרי שלהם (איור 1) 8,9, 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
הידבקות תא-מטריצה ותהליכי דה-הידבקות ניתן לכמת בצורה מדויקת בזמן אמת עם רזולוציה גבוהה זמנית באמצעות עכבת תא-מצע והדמיה תא חי ניתוחים. גישות אלה בזמן אמת מספקות יתרון גדול על פני נקודת סיום הניתוח של הידבקות תא, המספק פתרון זמני עני. על ידי במדויק כימות תגובות דה-ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant 568721 (SRT) and, in part, by a UNSW Faculty of Medicine Faculty Research Grant (MDR).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | – | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J. M., Davies, M. J. Oxidative damage to extracellular matrix and its role in human pathologies. Free Radic Biol Med. 44, 1973-2001 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4, 165-178 (2011).
- Baldus, S., et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration. J Clin Invest. 108, 1759-1770 (2001).
- Baldus, S., et al. Spatial mapping of pulmonary and vascular nitrotyrosine reveals the pivotal role of myeloperoxidase as a catalyst for tyrosine nitration in inflammatory diseases. Free Radic Biol Med. 33, 1010-1019 (2002).
- Thomas, S. R., Witting, P. K., Drummond, G. R. Redox control of endothelial function and dysfunction: molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Antioxid Redox Signal. 10, 1713-1765 (2008).
- Rees, M. D., et al. Myeloperoxidase-derived oxidants selectively disrupt the protein core of the heparan sulfate proteoglycan perlecan. Matrix Biol. 29, 63-73 (2010).
- Rees, M. D., et al. Targeted subendothelial matrix oxidation by myeloperoxidase triggers myosin II-dependent de-adhesion and alters signaling in endothelial cells. Free Radic Biol Med. 53, 2344-2356 (2012).
- Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B., Zheng, W. Application of real-time cell electronic sensing (RT-CES) technology to cell-based assays. Assay Drug Dev Technol. 2, 363-372 (2004).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Vissers, M. C., Thomas, C. Hypochlorous acid disrupts the adhesive properties of subendothelial matrix. Free Radic Biol Med. 23, 401-411 (1997).
- Ziv, N. E., Schiller, J. Differential Interference Contrast (DIC) Imaging of Living Cells. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kennett, E. C., et al. Peroxynitrite modifies the structure and function of the extracellular matrix proteoglycan perlecan by reaction with both the protein core and the heparan sulfate chains. Free Radic Biol Med. 49, 282-293 (2010).
- Sen, S., Ng, W. P., Kumar, S. Contractility dominates adhesive ligand density in regulating cellular de-adhesion and retraction kinetics. Ann Biomed Eng. 39, 1163-1173 (2011).
- Wildt, B., Wirtz, D., Searson, P. C. Programmed subcellular release for studying the dynamics of cell detachment. Nat Methods. 6, 211-213 (2009).
