Summary

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

Published: May 25, 2015
doi:

Summary

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Abstract

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Introduction

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine schwächende Erkrankung der Motoneuronen mit dem Verlust der beiden oberen und unteren motorischen Neuronen und damit Muskellähmung. Nach der Diagnose, ist das Überleben des Patienten auf nur 2-5 Jahren durchschnittlich 1. Zwerchfell Motor Neuron (PhMN) Verlust ist ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese der ALS. Patienten sterben schließlich durch den Verlust von PhMN Innervation der Membran, dem primären Muskelinspirations 2,3. Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist auch ein ernstes Problem im Zusammenhang mit Atembeschwerden. Etwa 12.000 neue Fälle von SCI treten jedes Jahr 4 aufgrund traumatischer Schädigung des Rückenmarks. Trotz Krankheit Heterogenität in Bezug auf Standort, Art und Schwere, die Mehrheit der SCI Fälle betreffen Trauma des zervikalen Rückenmarks, die oft zu einer schwächenden und anhaltenden Atem Kompromiss. Neben der ALS und SCI, anderen zentralen Nervensystems (ZNS) Erkrankungen können w zugeordnet werdenith Zwerchfellatemstörungen 5,6.

Die Zwerchfellnerv ist ein efferenten motorischen Nerven, die die ipsilateral Hemi-Diaphragma innerviert und stammt aus PhMN Zellkörper in den C3-C5 Ebenen des ipsilateralen Halsmark entfernt. PhMN Ausgang durch absteigend bulbospinal Eingang aus dem Hirnstamm in einem Gebiet wie dem rostralen ventralen respiratorischen Gruppe (rVRG) 7 bekannt gesteuert. Die rVRG-PhMN Membran Schaltung ist zentral für die Steuerung der inspiratorischen Atmung, sowie andere nicht-Ventilationsmembran Verhaltensweisen. Verschiedene traumatischen Verletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Schaltungen beeinflussen können, um eine tiefgreifende Rückgang der Lungenfunktion und Lebensqualität der Patienten führen. Nder Eingabe in PhMNs vom rVRG, PhMN Überleben, Phrenicus Integrität und korrekte Innervation am Diaphragma neuromuskulären Synapse (NMJ) sind alle für den normalen Membran-Funktion notwendig. Es ist daher wichtig, Techniken zu verwenden, dassquantitativ zu bewerten diese Schaltung in vivo in Tiermodellen von ALS, SCI und anderen ZNS-Erkrankungen.

Mit diesem Protokoll ist das Ziel, experimentelle Instrumente zur Bewertung PhMN Innervation des Zwerchfells sowohl auf der elektrophysiologischen und morphologischen Ebenen zu beschreiben. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) werden durch die Stimulierung alle efferenten motorischen Neurons Axone eines bestimmten motorischen Nerven und dann die Analyse der hervorgerufenen Depolarisation Reaktion der Ziel Muskelfasern aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann in vivo bei anästhesierten Ratten und Mäuse verwendet werden, um funktionelle Innervation des Hemidiaphragma durch PhMNs 8 quantifizieren. Aufgrund der Tatsache, dass CMAPs repräsentieren gleichzeitige Aufnahme aller (oder zumindest viele / die meisten) der Muskelfasern der gesamte Hemi-Membran ist es sinnvoll, auch die Phänotypen der einzelnen Motor Axonen und Muskelfasern an der Membran NMJ untersuchen, um Krankheit zu verfolgen – und therapierelevanten morphologischen Veränderungen, wie beispielsweise Teil und complete Denervierung, regenerative Sprießen und Reinnervation. Dies kann über ganze-mount Immunhistochemie (IHC) der Membran erreicht werden, gefolgt von detaillierten morphologischen Bewertung der einzelnen NMJs ganzen Muskel 9. Die Kombination CMAPs und NMJ Analyse bietet eine leistungsstarke Ansatz zur quantitativen Studium Zwerchfell Innervation in Nagetiermodellen von ZNS und PNS Krankheit.

Protocol

Experimentellen Verfahren wurden von der Thomas Jefferson University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates (2010/63 / EU, 86/609 / EWG und 87 bis 848 / EWG), der NIH Leitfaden für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Labortieren und der Society for Neuroscience der Richtlinien über die Verwendung von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung. 1. Verbindung Muskelaktionspotenti…

Representative Results

Erwachsene Sprague-Dawley Ratten erhielten entweder nur Laminektomie (unverletzt Kontrolle) oder einseitige Hemi-Prellung SCI an der C4 Rückenmarksebene 10-12. 5 Wochen nach der Operation, Spitzen CMAP Amplitude von aufgezeichneten die Hemi-Membran ipsilateral zur Laminektomie / Verletzungsstelle war maßgeblich an SCI-Ratten (2C) reduziert im Vergleich zu nur Laminektomie-Kontrolle (2B). Alle NMJs in der Hemi-Membran waren in Kontrolle nicht erkrankten Wildtyp-Ratten <stron…

Discussion

Als Atemfunktion wird sowohl traumatischen SCI und ALS beeinträchtigt, die Entwicklung von Therapien, die Atmung und speziell Membran Innervation Ziel sind klinisch relevante 5,6. Um die Atemfunktion umfassend zu studieren, sollte ein kombinierter Ansatz Methode verwendet werden. CMAPs messen den Grad der funktionellen Innervation des Zwerchfells durch externe Zwerchfellnervenstimulation, aber nicht endogenen bulbospinal Atemantrieb 8. Hinzu kommt, dass diese Aufnahmen nicht zur Untersuchung von m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Materials

Paraformaldehyde Fisher T353-500 Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 Invitrogen 10010049
2% Bovine serum albumin (2% BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) Sigma-Aldrich T9284-100mL Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
0.1M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 Concentration 1:400
SMI-312  Sternberger Monoclonals SMI312 Concentration 1:1,000
SV2 Developmental Studies Hybridoma Bank SV2-Supernatant Concentration 1:10
FITC goat anti-mouse IgG1 Roche 3117731001 Concentration 1:100
Silicone rubber Sylgard, Dow Corning Part # 184 Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
Vectashield fluorescent mounting medium Vector laboratories H-1000 This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors Fine Science Tools 15002-08
Dissection forceps Fine Science Tools 11295-51
Software for CMAP recordings Scope 3.5.6; ADI
Disk surface electrodes Natus neurology 019-409000
Subdermal needle electrodes Natus neurology 019-453100
Conductive gel Aquasonic  122-73720
Stimulator/recording system for CMAP recordings ADI Powerlab 8SP stimulator 
Amplifier for CMAP recordings BioAMP

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Cite This Article
Martin, M., Li, K., Wright, M. C., Lepore, A. C. Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons. J. Vis. Exp. (99), e52605, doi:10.3791/52605 (2015).

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