횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
근 위축성 측삭 경화증 (ALS)은 상하 운동 뉴런 및 그에 근육 마비 양자의 손실과 관련된 쇠약 운동 신경 질환이다. 진단시 환자의 생존 기간은 평균 만 2~5년 1에 있습니다. 횡격막 운동 신경 (PhMN) 손실은 루게릭 병의 발병 기전의 중요한 구성 요소입니다. 환자는 궁극적으로 인해 다이어프램의 PhMN의 신경 분포, 영감 2,3의 주요 근육의 손실을 죽는다. 외상성 척수 손상 (SCI)는 또한 관련된 호흡 곤란으로 심각한 문제이다. SCI 약 12,000 새로운 사례 인한 외상성 척수 손상으로 매년 4를 발생한다. 위치, 유형 및 정도에 대한 질병 이질성에도 불구하고, SCI의 대부분의 경우는 종종 쇠약과 지속적인 호흡 타협 결과 자궁 경부 척수에 외상을 포함한다. ALS 및 SCI 이외에, 다른 중추 신경계 (CNS) 질환 w 연관 될 수있다i 번째 횡격막 호흡 부전 (5, 6).
횡격막 신경은 동측 헤미 다이어프램을 innervates 원심성 운동 신경과 그 동측 경부 척수의 C3-C5 수준에있는 PhMN의 세포 기관에서 유래. PhMN 출력 입쪽 복부 호흡 기 (rVRG) 7로 알려진 지역에서 뇌간 bulbospinal 입력 내림차순에 의해 제어된다. rVRG-PhMN 다이어프램 회로 흡기 호흡뿐만 아니라, 다른 비 – 환기 다이어프램 동작의 제어 핵심이다. 이 회로에 영향을 미치는 다양한 외상과 퇴행성 신경 질환은 호흡 기능과 환자의 삶의 질에 심각한 감소로 이어질 수 있습니다. 다이어프램 신경 근육 접합 (NMJ)에서 rVRG, PhMN 생존, 횡격막 신경 무결성 및 적절한 신경 분포에서 PhMNs에 입력을 내림차순 정상 다이어프램 기능에 대한 모든 필요하다. 이 기술을 사용하는 것이 중요하다정량적으로 루게릭 병, SCI 및 기타 중추 신경계 질환의 설치류 모델에서 생체 내에서이 회로를 평가할 수 있습니다.
이 프로토콜에 의해, 목표 및 전기 생리 학적 수준 모두에서 다이어프램 PhMN의 신경 분포를 평가하는 실험 도구를 설명하기위한 것이다. 복합 근 활동 전위 (CMAPs) 지정된 운동 신경의 모든 원심성 운동 신경 축삭을 자극하고 표적 근섬유의 탈분극 유발 된 응답을 분석하여 기록된다. 이 기술은 8 PhMNs 의해 헤미 다이어프램의 기능적 신경 분포를 정량화하는 마취 된 쥐 생체 내에서 사용될 수있다. 인해 CMAPs는이 헤미 진동판 전체, 또한 질병을 추적하기 위해 다이어프램 NMJ에서 개별 모터 축삭 근섬유의 표현형을 확인하는 유용한 모든 (또는 적어도 대부분 / 대부분) 근섬유의 동시 기록을 나타낸다는 사실 – 이러한 부분 및 공단 등 치료 관련 형태 학적 변화테 탈 신경, 재생 돋 reinnervation. 이것은 근육 (9)에 걸쳐 개별적인 NMJs 형태의 상세한 평가를 한 후, 진동판의 전체 실장 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 달성 될 수있다. CMAPs를 결합하고 NMJ 분석은 정량적으로 중추 신경계와 말초 신경계 질환의 쥐 모델에서 횡격막 신경 분포를 연구하기위한 강력한 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
호흡 기능은 호흡 특히 다이어프램 신경 분포를 대상으로 치료법을 개발, 외상 SCI 및 루게릭 병에 모두 손상으로 임상 5,6 적합하다. 종합적 호흡 기능을 연구하기 위하여, 조합 된 접근 방법이 사용되어야한다. CMAPs 외부 횡격막 신경 자극의 방법에 의해 진동판의 기능적 신경 분포의 정도를 측정 할 수 있지만, 내인성 bulbospinal 호흡기 드라이브 8. 또한,이 녹음은, 특히 각각의 모터…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
