Функциональная и морфологическая оценка диафрагмы иннервации диафрагмального по мотонейронов
Summary
Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.
Abstract
This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.
Introduction
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является изнурительных болезнь двигательных нейронов, связанные с потерей верхних и нижних моторных нейронов и, как следствие паралич мышц. По диагностике, выживаемость пациентов в среднем на 2-5 лет только 1. Диафрагмального двигательных нейронов (PhMN) потеря критическим компонентом патогенеза БАС. Пациенты, в конечном счете умирают из-за потери PhMN иннервации диафрагмы, основной мышцы вдохновения 2,3. Травматический травмы спинного мозга (ТСМ), также серьезная проблема с затрудненным дыханием, связанных. Приблизительно 12000 новых случаев SCI происходит каждые 4 года в связи с травматическим повреждением спинного мозга. Несмотря заболевания неоднородности по отношению к местоположения, типа и тяжести, большинство случаев SCI привлекать травму шейного отдела спинного мозга, что часто приводит к изнурительной и упорной дыхательной недостаточности. В дополнение к ALS и ТСМ, другие центральной нервной системы (ЦНС), заболевания могут быть связаны WIth диафрагмальной дыхательной дисфункции 5,6.
Диафрагмальный нерв двигательный нерв, который иннервирует эфферентной ипсилатерального полугидрата диафрагму и происходит от PhMN клеточных тел, расположенных в уровне С3-С5 ипсилатеральных шейного отдела спинного мозга. Выход PhMN контролируется убыванию Bulbospinal вход от мозга в области, известной как ростральной брюшной дыхательных группы (rVRG) 7. RVRG-PhMN диафрагмой схема является центральным контролем вдоха дыхание, а также других не-вентиляционных поведения диафрагмы. Различные травматические повреждения и нейродегенеративные расстройства, которые влияют на эту схему может привести к резкому сокращению дыхательной функции и качества жизни пациентов. Убыванию вклад в PhMNs от выживания rVRG, PhMN, диафрагмального нерва целостности и надлежащего иннервации в нервно-мышечном соединении диафрагмы (НМС) все необходимое для нормальной функции диафрагмы. Поэтому важно использовать методы, которыеколичественно оценить эту схему в естественных условиях на моделях грызунов АЛС, SCI и других заболеваний ЦНС.
С этого протокола, цель описать экспериментальные инструменты для оценки PhMN иннервации диафрагмы как на электрофизиологические и морфологические уровнях. Соединение мышц потенциалы действия (CMAPs), отражаются путем стимулирования все эфферентной двигательных нейронов аксоны данного двигательного нерва, а затем анализируя вызываемые деполяризации ответ целевых мышечных волокон. Этот метод может быть использован в естественных условиях в анестезированных крыс и мышей количественно функциональной иннервации геми-диафрагмы по PhMNs 8. В связи с тем, что CMAPs представляете одновременную запись всех (или, по крайней мере, многие / большинство) мышечных волокон в целом Hemi-диафрагма, это также полезно изучить фенотипы отдельных аксонов двигательных и мышечных волокон на НМС диафрагмы для того, чтобы отслеживать болезни – и терапия актуальных морфологические изменения, такие как частичная и Комплексыте денервация, регенеративная прорастания и реиннервация. Это может быть достигнуто с помощью целом монтажа иммуногистохимии (IHC) диафрагмы, с последующим подробным морфологической оценки отдельных НМС по всей мышце 9. Сочетание CMAPs и НМС анализ обеспечивает мощный подход к количественной изучения диафрагмы иннервации в моделях грызунов ЦНС и ПНС болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как дыхательная функция нарушена и в травматическом ПСМ и БАС, разработки методов лечения, которые нацелены дыхание и, в частности диафрагмы иннервации являются клинически значимыми 5,6. Для того, чтобы всесторонне изучить дыхательную функцию, комбинированный метод подход должен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).
Materials
| Paraformaldehyde | Fisher | T353-500 | Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Concentration 1:400 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals | SMI312 | Concentration 1:1,000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Concentration 1:10 |
| FITC goat anti-mouse IgG1 | Roche | 3117731001 | Concentration 1:100 |
| Silicone rubber | Sylgard, Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| Vectashield fluorescent mounting medium | Vector laboratories | H-1000 | This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Software for CMAP recordings | Scope 3.5.6; ADI | ||
| Disk surface electrodes | Natus neurology | 019-409000 | |
| Subdermal needle electrodes | Natus neurology | 019-453100 | |
| Conductive gel | Aquasonic | 122-73720 | |
| Stimulator/recording system for CMAP recordings | ADI Powerlab 8SP stimulator | ||
| Amplifier for CMAP recordings | BioAMP |
References
- Miller, R. G., et al. Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force. Neurology. 52, 1311-1323 (1999).
- Sandhu, M. S., et al. Respiratory recovery following high cervical hemisection. Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).
- Kaplan, L. M., Hollander, D. Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis. Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).
- Holtz, A., Levi, R. . Spinal Cord Injury. , (2010).
- Bruijn, L. I., et al. ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions. Neuron. 18, 327-338 (1997).
- Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation. Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).
- Gourévitch, B., Mellen, N. The preBötzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat. Neuroimage. 98, 460-474 (2014).
- Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury. Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).
- Wright, M. C., et al. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats. Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).
- Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury. Nature. 475, 196-200 (2011).
- Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung. Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).
- Ngo, S. T., Bellingham, M. C. Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice. Neuromethods. 78, 225-235 (2013).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).
- Lepore, A. C., et al. Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS. PLoS One. 6, (2011).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).
