Évaluation des leucocytes infiltrant les tumeurs sous-ensembles dans un Modèle de tumeur sous-cutanée
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Cellules immunes spécialisées qui se infiltrent dans le microenvironnement tumoral régulent la croissance et la survie de la néoplasie. Les cellules malignes doivent éluder ou affaiblir les réponses immunitaires anti-tumorales afin de survivre et de se épanouir. Les tumeurs de profiter d'un certain nombre de différents mécanismes de immunitaire "fuite", y compris le recrutement de DC tolérogènes, des cellules T régulatrices immunosuppresseurs (Treg) et myéloïdes cellules suppressives dérivées (MDSC) qui inhibent les réponses cytotoxiques anti-tumoraux. Inversement, les cellules effectrices immunitaires anti-tumorales peuvent ralentir la croissance et le développement de tumeurs: les cellules dendritiques immunostimulateurs, les cellules tueuses naturelles qui abritent l'immunité anti-tumorale innée, et des cellules T cytotoxiques peut participer à toute suppression tumorale. L'équilibre entre pro et anti-tumorales leucocytes détermine finalement le comportement et le devenir des cellules transformées; une multitude d'études cliniques chez l'homme ont confirmé cette. Ainsi, l'analyse détaillée des sous-ensembles de leucocytes dans lesle microenvironnement de la tumeur est devenue de plus en plus importante. Ici, nous décrivons un procédé d'analyse des sous-ensembles de leucocytes infiltrants présents dans le micro-environnement de la tumeur dans un modèle de tumeur de souris. Des cellules de mélanome de souris B16 tumorales ont été inoculées par voie sous- cutanée dans des souris C57BL / 6. À un moment précis, les tumeurs et la peau environnante ont été réséquées en bloc et transformées en suspensions cellulaires simples, qui ont ensuite été colorées pour le multi-couleur cytométrie de flux. En utilisant une variété de marqueurs de leucocytes sous-ensemble, nous avons été en mesure de comparer les pourcentages relatifs des sous-ensembles de leucocytes infiltrant entre le contrôle et les tumeurs exprimant chémérine. Les chercheurs peuvent utiliser un tel outil pour étudier la présence immunitaire dans le microenvironnement de la tumeur et en conjonction avec les mesures de taille de l'étrier traditionnelles de la croissance de la tumeur, seront potentiellement leur permettre d'élucider l'impact des changements dans la composition immunitaire sur la croissance tumorale. Une telle technique peut être appliquée à ne importe quel modèle de tumeur dans laquelle la tumeur et son micro-environnement cune résection et traitées.
Introduction
L'équilibre entre la croissance de la tumeur et la promotion et la régression est, en partie, en fonction de l'équilibre des leucocytes infiltrant les tumeurs pro- et anti présents dans le microenvironnement 1,2. Afin d'étudier le microenvironnement tumoral (TME) et en particulier identifier les sous-populations de leucocytes infiltrant, nous avons développé une méthode d'évaluation des tumeurs sous-cutanées dans un modèle murin de la tumeur. L'importance de l'étude de la micro-environnement de la tumeur est bien connu et pris en charge dans la littérature. De nombreuses études ont démontré que la balance des cellules immunitaires pro et anti-tumorales infiltrant peut influer sur les résultats de la croissance tumorale, non seulement chez la souris mais aussi les études humaines (examinés dans 3,4). Par exemple, Curiel et al. Ont montré que les résultats cliniques ont empiré chez les patients atteints d'un cancer de l'ovaire ont été corrélées avec la présence des pourcentages croissants de cellules infiltrant les tumeurs de régulation (T CD4 + Treg) 5. Notre propre travail a également montré l'effet d'un pasvel chimiotactique des leucocytes sur les taux de sous-ensembles de leucocytes dans un modèle de mélanome de la souris 6, qui a également corrélée avec une diminution de la croissance tumorale. Ainsi, les analyses détaillées des sous-ensembles de leucocytes dans une tumeur est désormais plus largement reconnus et de plus en plus importante.
Il existe de nombreuses façons d'évaluer le microenvironnement de la tumeur pour l'infiltration des leucocytes; par exemple des groupes ont conçu des souris transgéniques pour exprimer différentes protéines fluorescentes pour imager la TME 7, immunohistochimie classique et immunofluorescence de sections conservés 8, y compris diverses modalités d'imagerie comme l'IRM, PET, microscopie confocale 9-11 – certains avec la capacité de surveiller intravitally 10,12. Ils peuvent être utilisés avec divers agents d'imagerie moléculaire, tels que 13 des nanoparticules ou des nouveaux agents de contraste 14 qui étiquette des cellules immunitaires. Notre méthode est une approche basée sur la cytométrie de flux et a plusieurs avantages.Tout d'abord, le micro-environnement de la tumeur entière peut être échantillonné; au moment de l'analyse, la totalité de la tumeur sous-cutanée et la périphérie environnante est réséquées chirurgicalement pour traitement. Ceci élimine tout biais potentiellement échantillonnage dans une seule tumeur et donne une analyse plus "global" de la tumeur dans son ensemble. Deuxièmement, en utilisant flux multicolore cytométrie d'analyser les sous-ensembles de leucocytes nous permet de mesurer plus précisément le phénotype de leucocytes infiltrants. Selon le nombre de couleurs utilisées, des sous-ensembles très spécifiques peuvent être identifiés. Ceci est important car il existe plusieurs sous-ensembles de leucocytes dans un type cellulaire particulier – ou même dans une classification générale du sous-type – qui ont des fonctions disparates qui sont potentiellement important dans la détermination du sort de la tumeur. Par exemple, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) ont été impliqués dans l'immunité anti-tumorale 15. Toutefois, le sous-ensemble de CCR9 + pDC a été démontré que 16 tolérogène, et décaler la balance d'un tel sous-ensemble peut avoir un impact sur la croissance tumorale.
Notre méthode est appropriée pour sous-cutanée ou d'autres tumeurs qui peuvent être réséquées en bloc. Dans nos mains, les tumeurs ont été réséquées uniforme au moment de l'euthanasie. Toutefois, il est concevable, comme cela a été fait dans certaines études, une tumeur sous-cutanée qui peut être entièrement réséquée avec fermeture de la peau environnante à une chirurgie de survie 17, permettant ainsi une évaluation supplémentaire de l'animal. L'analyse est ensuite réalisée sur la tumeur réséquée. Ainsi, les résultats représentent un seul point de temps dans le développement de la tumeur. Bien que cela permet une analyse détaillée dans le microenvironnement, ce est aussi une image statique de ce qui est sans aucun doute un processus dynamique. Cependant, les leucocytes isolés (par exemple par l'intermédiaire d'une séparation magnétique ou de gradient de densité) peut ensuite être analysé séparément de l'épithélium et le stroma de la tumeur, ou utilisés dans d'autres dosages fonctionnels, de définir plus précisément leur phénotype, comme cela a été précément décrit 18. Cette méthode, alors, serait utile pour tous les chercheurs intéressés à comprendre la composition des leucocytes dans le microenvironnement de la tumeur à un instant donné, que ce soit dans le cadre du cours naturel de la maladie, ou après une perturbation thérapeutique spécifique. Bien que non effectuée par nous, les variations de cette procédure peuvent aussi potentiellement être utilisés pour analyser des portions spécifiques d'une tumeur dans l'isolement. Par exemple, étant donné la taille de la tumeur, la zone (s) périphérique pourrait être disséquée du noyau central, éventuellement nécrotique de la tumeur pour donner aux chercheurs une vue plus spatialement séparées du microenvironnement de la tumeur.
Dans le domaine en plein essor de l'immunologie des tumeurs, il y aura sans aucun doute un nombre en croissance exponentielle des études évaluant de nouveaux agents immunomodulateurs dans les modèles de tumeurs murines. Plusieurs rapports ont mis en évidence les différences de fonction spécifique de leucocytes dans la tumeur par rapport au périphérique environnement. Par exemple, Shafer-Weaver et al. Ont montré dans un modèle de souris que T effecteurs spécifiques à l'antigène des cellules CD8 +, tant qu'il est actif dans la périphérie, ont été transformés dans des cellules suppressives T CD8 + une fois la traite dans le micro-environnement de la tumeur 19. Ce était en partie due à TGFß, mais d'autres facteurs sont susceptibles impliqué ainsi. Ainsi, l'évaluation des sous-ensembles de leucocytes – des chiffres et des ratios, ainsi que l'état fonctionnel – au sein de la tumeur elle-même donnera une représentation plus précise de l'effet d'une immunomodulation notamment sur le sort de la tumeur.
Notre technique permet une analyse détaillée de la tumeur et le chercheur fournit l'occasion d'identifier de plus près l'évolution des populations de leucocytes que les approches précédentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effectuer une analyse détaillée de la micro-environnement de la tumeur est essentielle pour déterminer les mécanismes et les effets de l'immunomodulation. Avec la présence croissante de l'immunothérapie dans le domaine clinique humaine, la compréhension de l'impact de ces agents sur les leucocytes infiltrant la tumeur devient nécessaire dans la définition de leur mécanisme d'action. Chez les humains, il existe souvent des problèmes cliniques et / ou de logistique pour l'obtention et l'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions R01-CA169354 et R01-047822 des Instituts nationaux de la santé et d'un prix d'excellence du ministère des Anciens Combattants (BCE). RKP a été soutenue par le NIH T32 CA009287-30A1, un Prix du jeune chercheur de l'ASCO, Californie Breast Cancer Research Project Fellowship, et d'un American Cancer Society Research Scholar encadrée Grant; BAZ a été soutenue par le NIH subvention AI079320. JM a été soutenu par des bourses des NIH T-32 subvention de formation T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 et American Cancer Society bourse post-doctorale PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
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