皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
腫瘍微小環境に侵入専門免疫細胞は、腫瘍の成長および生存を調節する。悪性細胞が生き残り、繁栄するために、抗腫瘍免疫応答を逃れるまたは覆す必要があります。腫瘍は、寛容原性DCの動員、免疫調節性T細胞（Tregの）、および細胞傷害性抗腫瘍応答を阻害骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）を含む免疫の異なる多数のメカニズム「脱出」を利用する。逆に、抗腫瘍エフェクター免疫細胞は、悪性腫瘍の成長および拡大を遅らせることができる。免疫刺激性樹状細胞は、生得的な抗腫瘍免疫を保有するナチュラルキラー細胞、および細胞傷害性T細胞は、すべての腫瘍抑制に関与することができる。プロ – および抗腫瘍、白血球との間のバランスは、最終的に行動し、形質転換された細胞の運命を決定する。ヒト臨床研究の多数がこれを裏付けている。内の白血球サブセットのため、詳細な分析腫瘍微小環境はますます重要になってきている。ここでは、マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍微小環境に存在する浸潤白血球サブセットを分析するための方法を記載する。マウスB16メラノーマ腫瘍細胞をC57BL / 6マウスに皮下接種した。指定された時間に、腫瘍および周囲の皮膚を一括切除し、次に、マルチカラーフローサイトメトリーのために染色した単一細胞懸濁液に加工。白血球サブセットマーカーのさまざまな方法を使って、私たちはコントロールとケマリン発現腫瘍の間で白血球サブセットを浸透させるの相対的な割合を比較することができました。研究者らは、腫瘍微小環境における免疫の存在を研究するためのそのようなツールを使用して、腫瘍増殖の従来のキャリパーサイズの測定と組み合わせた場合、潜在的に、それらは、腫瘍増殖に対する免疫組成の変化の影響を解明することを可能にすることができる。このような技術は、腫瘍とその微小環境cの任意の腫瘍モデルに適用することができる切除して処理すること。
Introduction
腫瘍増殖およびプロモーションと回帰とのバランスが、部分的には、微小環境1,2に存在するプロおよび抗腫瘍浸潤白血球のバランスに依存している。腫瘍微小環境（TME）を研究し、特に浸潤白血球亜集団を同定するために、我々は、マウス腫瘍モデルにおいて皮下腫瘍を評価するための方法を開発した。腫瘍微小環境を研究することの重要性はよく知られており、文献でサポートされています。多くの研究は、プロのバランスおよび抗腫瘍浸潤性免疫細胞がマウスでも（3,4に総説）ヒトの研究だけでなく、腫瘍増殖の結果に影響を与えることができることを示している。例えば、Curiel らは、卵巣癌患者の臨床転帰は、腫瘍浸潤調節性CD4 + T細胞（Tregの）5の割合を増加させるの存在と相関していたが悪化ことが示された。私たち自身の仕事も無いの効果を示したまた、減少、腫瘍増殖と相関したマウス黒色腫モデル6における白血球サブセットの比率にヴェル白血球走化性。このように、腫瘍内の白血球サブセットの詳細な分析は、今より広く認識され、ますます重要。
白血球浸潤のための腫瘍微小環境を評価するための多くの方法があります。例えば、グループはTME 7、例えばMRI、PET、共焦点顕微鏡9-11のような様々な撮像モダリティを含む保存部 8,9、古典的免疫組織化学および免疫蛍光画像への順序で種々の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを設計している-の能力を有するいくつかのintravitally 10,12監視します。これらは、免疫細胞を標識13または新規造影剤14ナノ粒子のような、種々の分子イメージング剤と共に使用することができる。我々の方法は、フローサイトメトリーに基づくアプローチであり、いくつかの利点を有する。まず、全体の腫瘍微小環境をサンプリングすることができる。解析時に、全体の皮下腫瘍とその周辺の周辺は、外科的に処理するために切除されている。これは、単一の腫瘍内の任意の潜在的にサンプリングバイアスを排除し、全体としての腫瘍の多くの「グローバル」な分析を提供します。第二に、白血球サブセットを分析するためにフローサイトメトリー多色フローを使用すると、私たちは、より具体的に浸潤白血球の表現型を測定することができる。使用される色の数に応じて、非常に特定のサブセットを同定することができる。あるいは一般的なサブタイプ分類 – – いくつかの白血球サブセットは、特定の細胞型内であるように、これは重要である腫瘍の運命を決定するのに潜在的に重要であり、異なる機能を持っている。例えば、形質細胞様樹状細胞（pDC）は、抗腫瘍免疫15に関係している。しかし、pDCはのCCR9 +サブセットは16寛容原性であることが示され、及びBaをシフトされていますこのようなサブセットのランスは、腫瘍増殖に影響を与える可能性がある。
我々の方法は、皮下または一括切除することができる他の腫瘍に適しています。私たちの手では、腫瘍は均一に安楽死の時点で切除した。いくつかの研究で行われているようしかし、皮下腫瘍が完全にこのような動物の追加の評価を可能にする、生存手術17における周囲の皮膚の閉鎖を切除することができること、が考えられる。分析は、その後切除腫瘍に対して行われる。このように、結果は、腫瘍の開発にシングルの時点を表す。これは微小環境を詳細に見てことができますが、それはまた、間違いなく動的なプロセスであるものの静止画です。しかし、単離された白血球（ 例えば介して磁気分離または密度勾配）previされているように、その後、腫瘍上皮および間質から別々に分析するか、さらにそれらの表現型を定義するために、他の機能的アッセイにおいて使用され得るously 18を説明した。この方法は、その後、天然の疾患経過の設定で、または特定の治療的摂動の後であれ、与えられた時点で、腫瘍微小環境内での白血球の組成を理解することに関心の任意の研究者のために有用であろう。我々が行っていないが、この手順のバリエーションはまた、潜在的に分離して、腫瘍の特定の部分を分析するために使用することができる。例えば、腫瘍の大きさを考えると、周辺ゾーン（S）は、研究者の腫瘍微小環境のより空間的に分離されたビューを提供するために、腫瘍の中央、おそらく壊死性コアから離れて解剖することができた。
腫瘍免疫学の急成長分野で、間違いなくマウス腫瘍モデルにおける新規免疫調節薬を評価する研究の指数関数的に増えては存在しません。いくつかの報告は、周辺EN対腫瘍内の特定の白血球機能の違いを強調しているvironment。例えば、シェーファー、ウィーバーらは、それらが腫瘍の微小環境19に売買されると、抗原特異的TエフェクターCD8 +細胞は、末梢におけるアクティブながら、CD8 + Tサプレッサー細胞を形質転換したマウスモデルで示した。これは、TGFβに一部だったが、他の要因は、おそらく同様に関与している。したがって、白血球サブセットの評価 – 数字や比率、ならびに機能状態を – 腫瘍自体の中では、腫瘍の運命の特定の免疫調節効果のより正確な表現を与える。
我々の技術は、腫瘍の詳細な分析を可能にし、研究者に、より密接従来のアプローチよりも白血球集団の変化を識別するための機会を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍微小環境の詳細な分析を実行するメカニズムおよび免疫調節の効果を決定する上で重要である。ヒト臨床分野における免疫療法の増加する存在と、腫瘍浸潤白血球上のこれらの薬剤の影響を理解することは、それらの作用メカニズムを定義するのに必要なになってきている。ヒトでは、しばしばこのように末梢免疫応答の分析を取得し、白血球サブセットの分析のために腫瘍組織を分析?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、助成金R01-CA169354によってサポートされていました とR01-047822 国立衛生研究所および退役軍人局（ECB）からの優秀賞から。 RKPは、NIH T32 CA009287-30A1、ASCO若手研究賞、カリフォルニア乳がん研究プロジェクトフェローシップ、および米国癌協会指導研究員助成によってサポートされていました。 BAZは、NIHの助成金AI079320によってサポートされていました。 JMは、NIHのT-32訓練助成金T32-AI07290- 25、T32-AI07290-24と米国癌協会ポスドクフェローシップPF-12-052-01-CSMから奨学金によってサポートされていました。
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
