Оценка опухоли инфильтрирующие лейкоцитов подмножеств в подкожной опухоли модели
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Специализированный иммунные клетки, которые проникают в микроокружение опухоли регулировать рост и выживание неоплазии. Злокачественные клетки должны ускользать или подорвать противоопухолевые иммунные ответы, чтобы выжить и процветать. Опухоли воспользоваться рядом различных механизмов иммунной "побега", включая вербовку толерогенную округ Колумбия, иммунодепрессанты регуляторные Т-клетки (регуляторные Т-клетки), и миелоидного происхождения супрессоров (MDSC), которые ингибируют цитотоксические реакции противоопухолевые. С другой стороны, противоопухолевый эффекторные иммунные клетки могут замедлить рост и расширение злокачественных новообразований: иммуностимулирующих дендритных клеток, естественных клеток-киллеров, которые несут врожденный иммунитет против опухоли, и цитотоксических Т-клеток все могут участвовать в подавлении опухоли. Баланс между про- и анти-опухолевых лейкоцитов в конечном счете определяет поведение и судьбу трансформированных клеток; Множество клинических исследованиях у человека уже это подтвердили. Таким образом, детальный анализ лейкоцитов подмножеств вмикросреда опухоль становится все более важным. Здесь мы опишем метод для анализа Проникнув лейкоцитов подмножеств, присутствующие в опухоли микроокружения в опухолевой модели мыши. Мышь В16 опухолевые клетки меланомы инокулировали подкожно в мышей C57BL / 6. В указанное время, опухоли и окружающую кожу иссекают единым блоком и обрабатываются в отдельных клеточных суспензий, которые затем окрашивали в течение многоцветной проточной цитометрии. Используя различные лейкоцитов подмножества маркеров, мы смогли сравнить относительные проценты проникновения лейкоцитов подмножеств между контролем и chemerin-выражения опухоли. Исследователи могут использовать такой инструмент для изучения иммунной присутствие в опухоли микроокружения и в сочетании с традиционными измерения размеров суппорт опухолевого роста потенциально позволит им выяснить влияние изменений в иммунной композиции на рост опухоли. Такой метод может быть применен к любой модели опухоли, в котором опухоль и его микроокружение Cбыть резекции и обрабатывается.
Introduction
Баланс между ростом опухоли и поощрения и регрессии, в частности, зависит от баланса про- и анти-опухолевых проникновения лейкоцитов, присутствующих в микросреде 1,2. С целью изучения микросреды опухоли (TME) и, в частности выявления Проникновение субпопуляций лейкоцитов, мы разработали метод для оценки подкожных опухолей на мышиной модели опухоли. Важность изучения микроокружение опухоли хорошо известна и поддерживается в литературе. Многочисленные исследования показали, что баланс про- и анти-опухолевых проникновения иммунных клеток может повлиять на результаты роста опухоли, а не только в мыши, но и человеческие исследования (обзор в 3,4). Например, Curiel и др. Показали, что ухудшило клинические результаты в больных раком яичников коррелировали с присутствием увеличение процентного содержания опухолевых-проникновения регулирующих CD4 + Т-клеток (Tregs) 5. Наша собственная работа также показал эффективность НетVel лейкоцитов хемоаттрактант от соотношения лейкоцитов подмножеств в модели меланомы мыши 6, в котором также коррелирует со снижением роста опухоли. Таким образом, подробный анализ лейкоцитов подмножеств в опухоли в настоящее время более широко признается и большее значение.
Есть много способов, чтобы оценить микросреду опухоли для проникновения лейкоцитов; например группы разработаны трансгенных мышей, чтобы выразить различные флуоресцентные белки для того, чтобы изображение TME 7, классическая иммуногистохимии и иммунофлуоресценции сохранившихся участков 8, в том числе различных методов визуализации, таких как МРТ, ПЭТ, конфокальной микроскопии 9-11 – некоторые со способностью следить прижизненно 10,12. Они могут быть использованы с различными молекулярными агентов визуализации, таких как наночастицы или 13 новых контрастных веществ 14, что метка иммунные клетки. Наш подход метод проточной цитометрии основе и имеет ряд преимуществ.Во-первых, вся микросреда опухоль можно попробовать; во время анализа, весь подкожной опухоли и окружающие периферии хирургическим резекции для обработки. Это исключает какой-либо потенциально дискретизации уклон в пределах одного опухоли и дает более «глобальный» анализ опухоли в целом. Во-вторых, с помощью многоцветной проточной цитометрии, чтобы проанализировать лейкоцитов подмножеств позволяет более конкретно оценить фенотип проникают лейкоцитов. В зависимости от количества используемых цветов, очень специфические подмножества могут быть определены. Это важно, поскольку есть несколько лейкоцитов подмножеств в конкретном типе клеток – или даже в генеральной классификации подтипа – которые имеют разнородные функции, которые являются потенциально значимым в определении судьбы опухоли. Например, плазмоцитов дендритные клетки (PDC) были вовлечены в противоопухолевого иммунитета 15. Тем не менее, CCR9 + подмножество PDCs было показано, что толерогенную 16, и смещение бакопье такого подмножества могут иметь влияние на рост опухоли.
Наш способ подходит для подкожного или других опухолей, которые могут быть резекции единым блоком. В наших руках, опухоли были равномерно резекции во время эвтаназии. Тем не менее, можно предположить, как это было сделано в некоторых исследованиях, которые подкожной опухоли может быть полностью резекции с закрытием окружающей кожи в хирургии выживания 17, таким образом позволяя дополнительную оценку животного. Анализ затем выполняется на удаленной опухоли. Таким образом, результаты представляют собой единый временной точке в развитии опухоли. Хотя это позволяет детально рассмотреть в микросреде, это также статическая картинка того, что, несомненно, динамичный процесс. Тем не менее, отдельные лейкоциты (например, с помощью магнитной сепарации или градиент плотности) может быть проанализирован отдельно от эпителия опухоли и стромы, или использоваться в других, функциональных анализов для дальнейшего определения их фенотип, как это было previменно описано 18. Этот метод, то было бы полезно для всех исследователей, заинтересованных в понимании состава лейкоцитов в пределах опухолевого микроокружения в данный момент времени, независимо от того в условиях естественного течения заболевания, или после определенного терапевтического возмущения. Хотя это и не сделано нами, вариации этой процедуры могут также потенциально быть использованы для анализа конкретных участков опухоли в изоляции. Например, если размер опухоли, периферийной зоной (ы) может быть отсечен от центральной, возможно, некротических ядро опухоли, чтобы дать исследователю более пространственно отделены вид на микроокружение опухоли.
В растущей области иммунологии опухолей, не будет, без сомнения, растет в геометрической прогрессии количество исследований, оценивающих новейших иммуномодулирующих агентов в мышиных моделях опухолей. Несколько отчетов выделяются различия в конкретных функциональных лейкоцитов в опухоли по сравнению с периферической ENсреды. Например, Шафер-Weaver и др. Показали на мышиной модели, что антиген-специфических Т-эффекторы CD8 + клеток, в то время как активность в периферии, были преобразованы в CD8 + Т-супрессорных клеток, когда они продают в опухоли микроокружения 19. Это было отчасти из-за TGF-beta, но и другие факторы, вероятно, участвует также. Таким образом, оценивая лейкоцитов подмножеств – числа и коэффициенты, а также функциональное состояние – в самой опухоли даст более точное представление о влиянии конкретной иммуномодуляцию на судьбе опухоли.
Наша методика позволяет детальный анализ опухоли и обеспечивает исследователю возможность более тесно определить изменения в лейкоцитарной населения по сравнению с предыдущими подходами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выполнение подробный анализ микросреды опухоли имеет решающее значение в определении механизмов и последствий иммуномодуляцию. С увеличением присутствия иммунотерапевтических в клинической сфере человека, понимания воздействия этих препаратов на опухолевые проникновения лейкоци…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами R01-CA169354 и R01-047822 из Национального института здоровья и поощрительных выплат от Департамента по делам ветеранов (ЕЦБ). РКП была поддержана NIH T32 CA009287-30A1, в ASCO для молодых исследователей Award, Калифорния груди Cancer Research Project стипендий и Американского общества рака наставником ученый-исследователь гранта; БАЗ была поддержана NIH грант AI079320. Миссия была поддержана стипендий от НИЗ T-32 субсидия на обучение T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 и Американского онкологического общества после защиты докторской диссертации общение PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
References
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O’Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677 (2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135 (2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034 (2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952 (2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94 (2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
