Ensayo de reclutamiento de células de pulmón Tumor
Summary
Este manuscrito describe un método para cuantificar la acumulación de células de tumor en los pulmones en un modelo animal de metástasis del tumor.
Abstract
Para investigar los mecanismos moleculares que rigen la metástasis del tumor, se han propuesto varias pruebas utilizando el ratón como un animal modelo. Aquí, demostramos un simple ensayo para evaluar extravasación de células tumorales o micrometástasis. En este ensayo, las células del tumor fueron inyectadas en la vena de la cola, y después de un corto período, los pulmones fueron disecados y digeridos para contar las células tumorales marcadas acumulada. Este análisis omite el paso inicial de la invasión del tumor primario en el vaso sanguíneo y facilita el estudio de los acontecimientos en el lejano órgano donde se produce la metástasis del tumor. El número de células que inyecta en los vasos sanguíneos puede ser optimizado para observar un número limitado de metástasis. Se ha reportado que las células estromales en el órgano distante contribuyen a la metástasis. Así, este análisis podrían ser una herramienta útil para explorar potenciales medicamentos o dispositivos para la prevención de metástasis del tumor.
Introduction
Metástasis del tumor responsable de alta mortalidad en enfermedades relacionadas con el cáncer. Desde el punto de vista de las investigaciones a nivel molecular, la metástasis se puede dividir en varios pasos: iniciación del tumor en el sitio del tumor primario, el crecimiento del tumor primario e invasión en alrededor de los tejidos, intravasación, circulación a través de los vasos sanguíneos , extravasación en órganos distantes y re-crecimiento del tumor. Cada paso implica diferentes conjuntos de moléculas/señales1.
Estudios hasta la fecha han estado preocupados con los eventos que ocurren en órganos distantes antes las células tumorales circulantes en la sangre, que también es conocida como la fase pre-metastásica2,3,4,5, 6. Nuestros estudios con ratones modelo revelaron que la fase pre-metastásica facilita la metástasis del pulmón mediante la creación de larga duración y bajo nivel de las respuestas inflamatorias en los pulmones. La fase pre-metastásica se caracteriza por hiperpermeabilidad de themicrovasculature y reclutamiento de células de la médula ósea derivada (BMDC), upregulation de citoquinas/quimioquinas-como moléculas incluyendo S100A8 y SAA33,4 . Se ha divulgado que esa lisil oxidasa modifica la matriz extracelular en los pulmones para reclutar BMDCs7. Otro informe ha revelado la importancia de Angpt2, MMP3 y MMP10 en la fase pre-metastásica8. En otras palabras, las intrincadas interacciones entre tumores primarios, médula ósea y órganos remotos necesitan ser comprendidos y modulada correctamente (por ejemplo, mediante el uso de fármacos que atacan las proteínas implicadas en estas interacciones) para evitar futuras metástasis9 . Para regular la fase pre-metastásica, debe primero visualizar y evaluar las intervenciones diagnósticas o terapéuticas. Aquí, Divulgamos un ensayo de reclutamiento de células de tumor de pulmón que permite el estudio de la fase pre-metastásico en los pulmones.
Las células del tumor inyectadas directamente en el vaso sanguíneo del ratón son similares a circulación las células del tumor en pacientes con cáncer, aunque puede haber diferencias entre las células cultivadas y células tumorales circulantes. Células tumorales circulantes se experimentan algunos cambios característicos cuando entran en circulación desde el tumor primario. Sin embargo, las células cultivadas pueden formar tumores en ratones inmunodeficientes cuando se inyectan en la vena de la cola. Además, en el sistema de modelo de ratón, fluorescencia marcada de las células del tumor puede utilizarse que permiten el seguimiento de estas células en el cuerpo. El comportamiento de las células tumorales en circulación es fundamental ya que determinan las consecuencias finales en cáncer pacientes10. Sangre no es un buen lugar para la supervivencia de las células de tumor2. Que necesitan para escapar del ataque por el sistema de inmune del huésped y necesita señales anti-apoptosis para evitar la apoptosis debido a la falta de soporte físico. Las células del tumor con mayores habilidades de iniciación de tumor en sitios metastáticos generan más nódulos del tumor. Si las células tumorales muestran tropismo de órgano específico, se deben observar metástasis en los órganos particulares. En este ensayo, los pasos iniciales de la cascada metastásica (crecimiento del tumor primario y la invasión) no están incluidos, y por lo tanto el foco está en la interacción entre la circulación de las células tumorales y las células del estroma (células endoteliales, células epiteliales y células de la sangre). En estudios de inyección de células de tumor convencional, los investigadores tienen que esperar hasta que los nódulos del tumor crecen hasta un tamaño tangible para detectar la metástasis. En este caso, no se puede cuantificar el número exacto de las células tumorales en los vasos sanguíneos. Además, este proceso incluye una fase de rebrote del tumor, indicando que otros factores en las células del tumor pueden afectar el resultado.
Conteo de las células del tumor bajo un estereomicroscopio de fluorescencia de etiquetado es un proceso simple. El estereomicroscopio proporciona un amplio campo de visión que puede analizarse el pulmón entero. Citometría de flujo es también una herramienta útil que al instante le da un número exacto de las células tumorales en el tejido. Conteo de células fluorescentes en el tejido bajo un microscopio confocal, es posible y muestra las imágenes más precisas de las células del tumor metastásico, pero requiere tiempo y puede dar resultados sesgados si sólo se cuenta un área seleccionada. El objetivo final de este ensayo es observar cómo fácilmente se acumulan las células del tumor en los pulmones. Como se informó anteriormente de3,4, si los pulmones están en fase de pre-metastásico debido a la señalización inflamatoria del tumor primario, las células tumorales inyectadas son propensas a acumular en los pulmones, por lo tanto, lo que implica mayor probabilidad de metástasis del pulmón. Otras condiciones (artritis reumatoide, asma, etc.) y su tratamiento con agentes antiinflamatorios (como anti-TNFα) pueden atenuar la metástasis del pulmón. Por lo tanto, concluimos que este análisis es una poderosa herramienta para evaluar la posibilidad de metástasis del pulmón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pretratamiento de ratones con anticuerpos, medicamentos, una dieta alta en grasas o medio condicionado por el tumor antes de la inyección de células de tumor es posible. El paso más difícil en este análisis es la inyección de la vena de la cola. Inyección incompleta da lugar a datos no concluyentes. La vena de la cola en C57BL/6 es particularmente difícil de identificar, dando por resultado las inyecciones fallidas. Colocando el ratón sobre una almohadilla de calefacción (37 ° C) ayuda a dilatar la vena de la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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