ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
המטרות תארו השיטה לנתח ריכוזי corticosterone בצואת סוסים כדי לספק הערכה לא פולשנית של פעילות כליה. מדידת ההיפותלמוס-היפופיזה-אדרנל (HPA) פעילות ציר היא גישה מקובלת ללמוד התגובה למצבים מרתיעים פוטנציאל בשני מיני בשבי ומקומיים. טכניקת התייחסות השיטה הנפוצה ביותר היא השימוש פלזמת דם 1 עם זאת, שיטות חלופיות כגון ניתוח צואה פותחו כדי להתגבר על הלחץ הנגרם על ידי לקיחת דמים עצמו ולאפשר את היכולת לפקח מינים הנעים בחינם.
במהלך מצב מרתיע, הומאוסטזיס פיסיולוגי מופר. ההיפותלמוס ב המוח משחרר corticotrophin משחררים הורמון (CRH) אשר פועלת על בלוטת יותרת המוח הקדמית ומעורר שחרור הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (ACTH). ACTH נכנס לזרם הדם ומעורר את קליפת יותרת הכליה להפריש מצלצליםזה גלוקוקורטיקואידים ספציפיים (GC). Glucocorticoids מתקיים קשר הדוק לאירועים מלחיצים ולא שיופק באופן עקבי בכל המדינות מוגברות האנרגיה ולכן הם נמדדים לעתים קרובות עדיפים על פני הורמונים צמודי מתח אחרים 2. Glucocorticoids אחראי מספר השפעות אדפטיבית בסוסים. אנרגיה מגויסת במהירות מאתרי אחסון בגוף בצורה של חומצות שומן וגלוקוז, צריכת חמצן מוגברת, תפקוד חושי הוא משופר 3 ואת זרימת דם יורדת לאזורים אין צורך לתנועה 4. כמו גם מתנהג כמו מנגנון התמודדות, עליית המתח המושרית ב Glucocorticoids עשויה גם לעזור להכין את חית הדחק הבא 5.
הערכת רמות הורמוני הפלזמה ורוק כרוך מדידת ההורמון במחזור בפועל לעומת זאת, מדידת מטבוליטים אמצעי צואת המוצר הסופי המטבולית של ההורמון. סטרואידים במחזור הם catabolized ב lIver לפני ההפרשה אל המרה שם הם עוברים שינויים נוספים בהנחייתם של הפעילות אנזימטית של פלורת חיידקים בתוך מסלול מעי 6. לכן, immunoassays מכוונת גלוקוקורטיקואידים דם ואינה מתאימה לניתוח של מטבוליטים בסטרואידי צואת 7.
כמו אוסף צואה יכול להתבצע ללא הפרעה אל הסוס, ניתוח ובצואה corticosterone, כבר נעשה שימוש נרחב כדי לעקוב אחר פעילות HPA בכמה נסיבות. Corticosterone הגבוהה בצואה של סוסים דווחה בתגובה למצבים מרתיעים פוטנציאל כלל במהלך טיפול וטרינרי ניתוח שלאחר 8 ו בדיור 9 מגבילים. דגימת צואה משקפת רמה בסטרואידים נקוותה לאורך זמן ולא טעם דגימת זמן המוצע על ידי פלזמה ורוק מה שהופך אותו מתאים לניטור ארוך טווח, כרוני או דפוסים עונתיים 10. בשל פולשניטבעה של השיטה, דגימות ניתן לאסוף שוב ושוב ליחיד ללא צורך ללכוד או ריסון 11. עם זאת, זמן מעבר במעי ספציפי מינים חייב להילקח בחשבון בעת תכנון פרוטוקול דגימה. בסוסים, זמן מעבר במעי הוא סביב 18 שעות 12 ולכן, תגובת כלית מטבוליטים corticosterone עוקבים ניתן לאתר בצואה יום אחד לאחר הפעלה ראשונית של ציר HPA.
כאשר ניצול טכניקות immunoassay פולשני אימות זהירה עבור המין הנחקרת היא 13 חיונית. בנוסף, קיימים הבדלים בין המגדרים בהפרשת הורמון המטבוליט דווחו ככל הנראה בשל הבדלים בקצב חילוף החומרים וסוג המטבוליט corticosterone מופרש מינים שונים, כולל עכברים 14, ותרנגולות 15. לכן היה חשוב כחלק בשיטה זו כי assay שקיבל תוקף לשימוש גם זכר וגם נקבה סוסים המקומי כפי מפורט הפרוטוקול הדואר. להבדל הזה במטבוליזם הורמון בין המינים השלכות על איכות הנתונים ובכל זאת לעתים רחוקות התייחס וכלל כחלק מאימות assay.
שיטה לא פולשנית זו מאפשרת הערכה לטווח ארוכה של פעילות כליה בסוסים מקומיים. פרטי הפרוטוקול הוא האימות של assay ואת טכניקת assay עצמו.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח corticosterone צואה מספק אמצעי להערכת דפוסים לטווח ארוך של פעילות כליה בסוסים. האופי הלא-פולשני של השיטה מתגבר על תופעות בלבול של שיטות דגימה אחרות המשמשות כדי להעריך את פעילות כליה כוללים ניתוח רוק פלזמה 9. בנוסף הטכניקה יש יתרון לא פולשנית ברורה אם לומדים סוסי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
