Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
Gli obiettivi metodo descritto per analizzare le concentrazioni di corticosterone nelle feci equine per fornire una valutazione non invasiva dell'attività surrenale. Misurazione dell'attività (HPA) dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene è un approccio accettato di studiare la risposta a situazioni potenzialmente avversi in entrambe le specie in cattività e nazionali. La tecnica di riferimento e il metodo più diffuso è l'uso di plasma sanguigno 1 Tuttavia, metodi alternativi come l'analisi fecale sono state sviluppate per superare lo stress indotto mediante campionamento sangue stesso e permettere la possibilità di monitorare le specie che vanno.
Durante una situazione di avversione, l'omeostasi fisiologica è interrotta. L'ipotalamo nel cervello rilascia ormone di rilascio della corticotropina (CRH), che agisce sulla ghiandola pituitaria anteriore e stimola il rilascio di ormone adrenocorticotropo (ACTH). ACTH entra nel flusso sanguigno e stimola la corteccia surrenale a secernere species glucocorticoidi specifici (GC). I glucocorticoidi sono strettamente legate ad eventi stressanti piuttosto che essere prodotta in modo coerente in tutti gli stati di energia accresciuta quindi sono spesso misurati in preferenza rispetto ad altri di stress legato ormoni 2. I glucocorticoidi sono responsabile di diversi effetti di adattamento nei cavalli. Energia viene rapidamente mobilizzato da siti di stoccaggio nel corpo sotto forma di acidi grassi e glucosio, assunzione di ossigeno viene aumentata, funzione sensoriale è migliorata 3 e il flusso di sangue è diminuita ad aree non necessarie per il movimento 4. Così come in qualità di un meccanismo di coping, l'aumento indotto stress nella glucocorticoidi può anche aiutare a preparare l'animale per il prossimo 5 fattore di stress.
Valutare livelli dell'ormone nel plasma e nella saliva coinvolge misurare l'ormone effettivo circolante Tuttavia, misurando i metaboliti nelle misure feci il prodotto finale del metabolismo dell'ormone. steroidi circolanti sono catabolizzati nella liver prima di escrezione della bile dove subiscono ulteriori modifiche facilitati dalle attività enzimatiche della flora batterica intestinale all'interno della traccia 6. Pertanto, saggi immunologici diretti verso glucocorticoidi nel sangue può non essere adatto per l'analisi dei metaboliti fecali glucocorticoidi 7.
Come raccolta fecale può essere effettuata con nessun disturbo al cavallo, analisi delle feci per corticosterone, è stato ampiamente utilizzato per monitorare l'attività HPA in una serie di circostanze. Corticosterone elevata nelle feci dei cavalli è stata riportata in risposta a situazioni potenzialmente avversi anche durante post-operatorio trattamento veterinario 8 e nelle abitazioni restrittiva 9. Campionamento fecale riflette un livello di glucocorticoide pool nel corso del tempo, piuttosto che il punto di campionamento in tempo offerto dal plasma e la saliva che lo rende adatto per il monitoraggio a lungo termine, cronica o modelli stagionali 10. A causa della non-invasivanatura del metodo, i campioni possono essere ritirati ripetutamente per un individuo senza la necessità di cattura o di ritenuta 11. Tuttavia, specie specifica il tempo di transito intestinale deve essere preso in considerazione quando si pianifica un protocollo di campionamento. Nei cavalli, il tempo di transito intestinale è di circa 18 ore 12 Pertanto, la risposta surrenale e successive metaboliti corticosterone possono essere rilevati nelle feci un giorno dopo attivazione iniziale dell'asse HPA.
Quando utilizzando tecniche non invasive immunodosaggio una validazione accurata per le specie oggetto di indagine è essenziale 13. Inoltre, le differenze di sesso ormone metaboliti sono stati segnalati probabilmente a causa di differenze nel tasso metabolico e il tipo di metabolita corticosterone escreto nelle varie specie, tra cui topi, 14 e polli 15. Era quindi importante nell'ambito di questo metodo che il test è stato convalidato per l'uso in maschi e femmine cavalli domestici come dettagliato in the protocollo. Questa differenza nel metabolismo ormonale tra i generi ha conseguenze per la qualità dei dati eppure raramente si rivolge e incluso come parte di convalida del test.
Questo metodo non invasivo consente la valutazione a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli domestici. I dettagli del protocollo sia la validazione del test e la tecnica di analisi in sé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analisi corticosterone fecale fornisce un mezzo per valutare i modelli a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli. La natura non invasiva del metodo supera gli effetti confondenti di altri metodi di campionamento utilizzati per valutare l'attività del surrene tra cui saliva e nel plasma analisi 9. Inoltre la tecnica ha un vantaggio non invasivo chiaro se lo studio cavalli liberi che vanno.
Ci sono diversi punti chiave da discutere riguardo a questo metodo e il suo u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
