Фекальные глюкокортикоиды Анализ: безоперационная Надпочечная Мониторинг в Equids
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
Метод, описанный предполагает анализ концентрации кортикостерона в лошадиного кала, чтобы обеспечить неинвазивный оценку надпочечниковой активности. Измерение гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) оси деятельности является общепринятым подходом к изучению реакции на потенциально аверсивных ситуации в обоих неволе и домашних видов. Эталонный метод и наиболее широко используемым методом является использование плазмы крови 1 , однако, альтернативные методы , такие как фекальные анализа были разработаны для того , чтобы преодолеть стресс , вызванный самой забора крови и позволяет возможность отслеживать свободные диапазоне видов.
Во время аверсивного ситуации, физиологический гомеостаз нарушается. Гипоталамус в выпусках мозга кортиколиберин (CRH), который действует на передней доли гипофиза и стимулирует высвобождение адренокортикотропного гормона (АКТГ). АКТГ поступает в кровоток и стимулирует кору надпочечников секретируют звонкойспецифичный глюкокортикоиды (GC). Глюкокортикоиды тесно связаны с стрессовыми событиями , а не последовательно производится во всех энергетических состояниях повышенной , поэтому они часто измеряется предпочтение по сравнению с другими стресс – связанных гормонов 2. Глюкокортикоиды ответственны за несколько адаптивных эффектов у лошадей. Энергия быстро мобилизован из мест хранения в организме в виде жирных кислот и глюкозы, потребление кислорода увеличивается, сенсорная функция усиливается 3 и кровоток уменьшается на области , не необходимых для движения 4. А также действует как механизм преодоления трудностей, то стресс , вызванный рост глюкокортикоидов может также помочь подготовить животное к следующему стрессора 5.
Оценка уровней гормонов в плазме и слюне включает в себя измерение фактического циркулирующего гормона, однако, измерение метаболитов в мерах фекалии метаболический конечный продукт гормона. Циркулирующие стероиды катаболизировано в лIver , прежде чем экскреции с желчью , где они подвергаются дальнейшим изменениям , облегченные ферментативной активности бактериальной флоры в кишечном дорожки 6. Таким образом, иммунологические тесты, направленные к глюкокортикоидов в крови не могут быть пригодны для анализа фекальных глюкокортикоидных метаболитов 7.
Как сбора фекалий может осуществляться без каких-либо помех на лошади, анализ кала на кортикостерона, широко используется для мониторинга активности HPA в ряде обстоятельств. Повышенные кортикостерона в фекалиях лошадей было сообщено в ответ на потенциально аверсивных ситуациях , включая во время послеоперационного ветеринарии для лечения 8 и в ограничительной корпусе 9. Фекальные выборки отражает уровень объединял глюкокортикоиды с течением времени , а не момент времени выборки , предлагаемой плазме и слюне , что делает его подходящим для мониторинга на долгий срок, хронический или сезонный характер 10. В связи с неинвазивнымприроды метода, образцы могут быть собраны несколько раз для индивидуума без необходимости захвата или ограничения 11. Тем не менее, определенные разновидности кишки транзитное время должны быть приняты во внимание при планировании протокола отбора проб. У лошадей, время прохождения кишка составляет около 18 ч 12 поэтому, надпочечниковой ответ и последующие кортикостерона метаболиты могут быть обнаружены в кале через один день после первоначальной активации оси HPA.
При использовании неинвазивных методов иммунологического тщательное обоснование для данного вида расследуется имеет важное значение 13. Кроме того, половые различия в гормональном метаболит экскреции сообщалось , вероятно , из – за различий в скорости обмена веществ и типа кортикостерона метаболита выводится из организма у различных видов , включая мышей , 14 и 15 кур. Поэтому важно, как часть этого метода, что анализ был апробирован для использования в мужских и женских домашних лошадей, как подробно описано в гое протокола. Эта разница в гормональном обмене веществ между мужчинами и женщинами имеет последствия для качества данных пока она редко рассматриваются и включены как часть проверки анализа.
Этот неинвазивный метод позволяет долгосрочную оценку надпочечниковой активности в домашних лошадей. Подробности протокола и проверки достоверности анализа и сама методика анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фекальные анализ кортикостерона предоставляет средства оценки долгосрочных моделей надпочечниковой активности у лошадей. Неинвазивный характер метода преодолевает искажающие эффекты других методов отбора проб , используемых для оценки активности коры надпочечников , включая слюн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
