Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues
Summary
We beschrijven een eenvoudige en snelle experimentele procedure voor het genereren van primaire fibroblasten uit de oren en staarten van muizen. De werkwijze vereist geen speciale dierendressuur en kan worden gebruikt voor het genereren van fibroblast cultures van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen.
Abstract
Primaire cellen zijn direct afgeleid uit weefsel en men denkt dat meer representatief voor de fysiologische toestand van cellen in vivo dan gevestigde cellijnen. Echter, primaire celculturen hebben meestal een beperkte levensduur en moeten worden vaak hersteld. Fibroblasten zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van primaire cellen. Hier bespreken we een eenvoudige en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. Het protocol kan worden gebruikt om primaire fibroblast kweken vaststellen van oren opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen. Wanneer het protocol nauwkeurig gevolgd, verontreinigingen waarschijnlijk optreden, ondanks het gebruik van niet-steriele opgeslagen voor langere tijd in sommige gevallen. Fibroblasten vermenigvuldigen zich snel in de cultuur en kan worden uitgebreid tot aanzienlijke aantallen voor het ondergaan van replicatieve veroudering.
Introduction
Primaire cellen zijn afkomstig van levende weefsels en gekweekt onder in vitro omstandigheden. Algemeen wordt aangenomen dat primaire cellen meer lijken op de fysiologische toestand en de genetische achtergrond van het weefsel waaruit ze afkomstig zijn dan geïmmortaliseerde of tumorcellijnen 1. Om die reden, primaire cellen vormen een bruikbaar model voor het bestuderen van biologische vraagstukken 2,3. Anders dan gevestigde cellijnen die oneindig groeien primaire cellen uiteindelijk ondergaan senescentie in kweek en moeten vaak hersteld.
Algemeen gebruikte primaire cellen omvatten fibroblasten, epitheelcellen, endotheelcellen, T-cellen, B-cellen, beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) en beenmerg afgeleide dendritische cellen (BMDC). Fibroblasten worden vaak gebruikt als primaire celcultuur model. Ze bieden belangrijke voordelen ten opzichte van andere primaire cellen. Celculturen worden gemakkelijk vastgesteld, gemakkelijk onderhouden en vereisen geen Purificatie van de cellen voorafgaand aan de cultuur. Ze hebben een snelle initiële proliferatie en geen vereiste voor specialistische middelgrote of activering protocollen. Fibroblasten kunnen efficiënt worden getransfecteerd met behulp van biologische, chemische en fysische protocollen 4,5. Er is een mogelijkheid om de oren slaan voor maximaal 10 dagen bij kamertemperatuur voorafgaand aan vaststelling van celculturen. Fibroblastculturen bevorderlijk zijn voor visualisatie van cytoplasmatische processen en geschikt voor het herprogrammeren in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen 6.
Fibroblasten zijn belangrijke cellen van het bindweefsel dat collageen eiwitten en extracellulaire matrix 7 uitscheiden. Zij bieden de structureel kader in vele weefsels 8 en spelen een essentiële rol in de wondgenezing en weefselherstel 9,10.
Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle (<4 uur) protocol om fibroblast culturen uit oren en staarten van muizen 11 vast te stellen. Het protocol vereist minimale muiservaring om de weefsels te oogsten (in tegenstelling tot andere protocols 12,13) en kan worden gebruikt om kweken van oren opgeslagen in medium bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 dagen vast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier geven we een eenvoudige, goedkope en snelle testprocedure primaire fibroblast kweken van oren en staarten van muizen vastgesteld. De extractie moet resulteren in hechtende en snel delende fibroblasten binnen 3 dagen na isolatie van het weefsel. Een belangrijke beperking van primaire cellen veroudering, een permanente groeistop 15. Met behulp van het protocol kan fibroblast kweken worden doorgekweekt gedurende 5 tot 6 keer vóór fibroblasten worden senescente, aangegeven door de afvlakking van de cellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
Materials
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
- Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
- Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
- Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
- Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
- Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
- Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
- Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
- Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
- Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
- Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).
