Summary

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Published: January 10, 2016
doi:

Summary

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Abstract

Primärzellen werden direkt aus Gewebe gewonnen und sind gedacht, um mehr repräsentativ für den physiologischen Zustand der Zellen, die in vivo als etablierte Zelllinien sein. Jedoch weisen primäre Zellkulturen in der Regel eine begrenzte Lebensdauer und häufig wiedereingeführt werden müssen. Fibroblasten sind eine leicht zugängliche Quelle von Primärzellen. Hier diskutieren wir eine einfache und schnelle Versuchsdurchführung zu primären Fibroblastenkulturen von Ohren und Schwanz von Mäusen zu etablieren. Das Protokoll kann die primäre Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden, zu etablieren. Wenn das Protokoll genau befolgt, sind Verunreinigungen unwahrscheinlich, trotz der Verwendung für längere Zeit in einigen Fällen nicht gespeichert unsterilen Gewebe auftreten. Fibroblasten vermehren sich rasch in Kultur und kann zu einer beträchtlichen Zahl vor einer replikativen Seneszenz erweitert werden.

Introduction

Primärzellen werden von lebendem Gewebe und kultiviert unter in vitro Bedingungen abgeleitet sind. Es wird allgemein angenommen, dass primäre Zellen, die den physiologischen Zustand und der genetische Hintergrund des Gewebes, aus dem sie stammen, als immortalisierte oder Tumorzelllinien 1 stärker ähneln. Aus diesem Grund Primärzellen sind ein nützliches Modell für die Untersuchung biologischer Fragestellungen 2,3. Doch im Gegensatz zu etablierten Zelllinien, die auf unbestimmte Zeit zu wachsen, Primärzellen schließlich unterziehen Seneszenz in Kultur und häufig wiedereingeführt werden müssen.

Üblicherweise verwendete primäre Zellen umfassen Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, T-Zellen, B-Zellen, Knochenmark-Makrophagen (BMDM) und Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC). Fibroblasten werden oft als primäre Zellkultur-Modell genutzt. Sie bieten entscheidende Vorteile gegenüber anderen Primärzellen. Die Zellkulturen werden leicht hergestellt, leicht aufrechterhalten und erfordern keine Purification der Zellen vor der Kultur. Sie haben schnellen anfänglichen Proliferation und keine Voraussetzung für die Fachmedium oder Aktivierungsprotokolle. Fibroblasten lassen sich effizient mit biologischen, chemischen und physikalischen Protokollen 4,5 transfiziert werden. Gibt es eine Möglichkeit, um die Ohren für bis zu 10 Tage bei RT vor der Etablierung von Zellkulturen zu speichern. Fibroblastenkulturen sind förderlich für die Visualisierung von zytoplasmatischen Prozesse und für die Neuprogrammierung in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 6.

Fibroblasten sind wichtige Zellen des Bindegewebes, die Kollagen-Proteine ​​der extrazellulären Matrix 7 sekretieren. Sie stellen den strukturellen Rahmen in vielen Geweben 8 und spielen eine wesentliche Rolle bei der Wundheilung und Gewebereparatur 9,10.

Hier beschreiben wir eine einfache und schnelle (<4 h) Protokoll, um Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse 11 zu etablieren. Das Protokoll erfordert nur minimale MausErfahrung, um das Gewebe (im Gegensatz zu anderen Protokollen 12,13) ​​zu ernten und kann verwendet werden, um Kulturen von Ohren in Medium bei RT für bis zu 10 Tage gelagert zu etablieren.

Protocol

Die Mäuse wurden in pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts bis Euthanasie (The Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien an der National University of Singapore und der National Advisory Committee für Labortierforschung (NACLAR) Richtlinien) untergebracht ist. 1. Mäuse Bestellen Sie eine Maus der entsprechenden genetischen Hintergrund. Dieses Protokoll basiert auf Gewebe von einer C57BL / 6-Mäusen abgeleitet wurden. <p…

Representative Results

Extraktion von Fibroblasten, die aus Gewebe in einer signifikanten Menge an Gewebetrümmer (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Gewebetrümmer, Fibroblasten haften an Gewebekulturkunststoffoberflächen zwischen Tag 1 und 3 der Kultur. Das Medium der Fibroblastenkulturen kann sicher an Tag 3 der Kultur, die die Pegel der vorliegenden Trümmer in der Kultur (2) signifikant verringern sollte verändert werden. Fibroblasten zeigen eine längliche Morphologie und eine deutlich sichtbare Zytoplasma…

Discussion

Hier stellen wir eine einfache, kostengünstige und schnelle experimentelle Verfahren zur primären Fibroblastenkulturen aus den Ohren und Schwänze der Mäuse zu etablieren. Die Extraktion sollte in haftende und sich schnell teilenden Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen nach der Trennung des Gewebes führen. Eine wichtige Einschränkung von Primärzellen ist Seneszenz, eine dauerhafte Wachstumsstillstand 15. Verwendung des Protokolls kann Fibroblastenkulturen für 5-6 mal passagiert werden, bevor Fibroblasten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Materials

RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

References

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Cite This Article
Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

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