Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo
Summary
Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.
Abstract
Cellule primarie derivano direttamente dal tessuto e si pensa di essere più rappresentativo dello stato fisiologico delle cellule in vivo di linee cellulari stabilizzate. Tuttavia, colture cellulari primarie di solito hanno una durata di vita limitata e devono essere frequentemente ristabilita. I fibroblasti sono una fonte facilmente accessibile di cellule primarie. Qui, si discute una procedura semplice e rapida sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. Il protocollo può essere utilizzato per stabilire colture primarie di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni. Quando il protocollo è attentamente seguita, contaminazioni sono improbabili nonostante l'uso di tessuti non sterile immagazzinato per tempo prolungato in alcuni casi. I fibroblasti proliferano rapidamente in coltura e possono essere espanse per un numero considerevole prima di subire la senescenza replicativa.
Introduction
Cellule primarie sono derivati da tessuti e coltivate che vivono in condizioni in vitro. Si ritiene generalmente che le cellule primarie avvicinano maggiormente lo stato fisiologico e background genetico del tessuto da cui sono derivati di linee cellulari immortalizzate o tumorali 1. Per questo motivo, cellule primarie rappresentano un modello utile per studiare le domande biologica 2,3. Tuttavia, a differenza di linee cellulari stabilizzate che crescono indefinitamente, pile infine subiscono senescenza nella cultura e devono essere frequentemente ristabilita.
Pile comunemente usati includono fibroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, cellule T, cellule B, i macrofagi del midollo osseo (BMDM) e le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BMDC). I fibroblasti sono spesso utilizzati come cellula primaria modello di coltura. Essi offrono vantaggi chiave rispetto ad altre cellule primarie. Le colture cellulari sono facilmente stabiliti, prontamente mantenuto e non richiedono purificazione di cellule precedenti alla cultura. Hanno rapida proliferazione iniziale e nessun requisito per i protocolli di media o di attivazione specializzate. I fibroblasti possono essere efficacemente trasfettate utilizzando protocolli fisici 4,5 biologici, chimici, e. C'è la possibilità di memorizzare le orecchie fino a 10 giorni a temperatura ambiente, prima di stabilire colture cellulari. Colture di fibroblasti sono favorevoli alla visualizzazione dei processi citoplasmatici e adatto per la riprogrammazione in staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 6.
I fibroblasti sono importanti cellule del tessuto connettivo che secernono proteine collagene e della matrice extracellulare 7. Essi costituiscono il quadro strutturale in molti tessuti 8 e svolgono un ruolo fondamentale nella guarigione delle ferite e la riparazione dei tessuti 9,10.
Qui, descriviamo un protocollo (4 ore <) semplice e veloce per creare colture di fibroblasti da orecchie e le code di topo 11. Il protocollo richiede una minima del mouseesperienza per raccogliere i tessuti (a differenza di altri protocolli 12,13) e può essere utilizzato per stabilire culture di orecchie memorizzati nel mezzo a temperatura ambiente per 10 giorni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui forniamo una procedura semplice, economico e veloce sperimentale di stabilire colture di fibroblasti primari da orecchie e le code di topi. L'estrazione dovrebbe risultare in fibroblasti divisorie aderenti e rapidamente entro 3 giorni post-isolamento del tessuto. Un importante limite di pile è senescenza, una crescita arresto permanente 15. Utilizzando il protocollo, colture di fibroblasti possono essere diversi passaggi da 5 a 6 volte prima fibroblasti diventano senescente, indicato dalla appiattime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.
Materials
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Asparagine | Sigma-Aldrich | A4159 | |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| Ethanol | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile |
| Pronase protease | Merck Millipore | 53702 | From Streptomyces griseus |
| Tris buffer (pH 8) | 1st BASE | 1415 | Ultra pure grade |
| 0.5M EDTA (pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | Biotechnology grade |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | Ultra pure grade |
| Trypsin-EDTA solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2492-20ml | 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered |
| Scissors | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μM syringe filter | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μM cell strainer | SPL | 93070 | |
| Syringe plunger | Terumo | SS+10L | |
| Cryovial tube | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm cell culture dish | Greiner | 664160 | Cell culture treated dish |
| 15 ml conical bottom tube | Greiner | 188271 | |
| 50 ml conical bottom tube | Greiner | 227261 | |
| Water bath | GFL | 1002 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Incubation shaker | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 light microscope | Carl Zeiss AG |
References
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