生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで
Summary
ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。
Abstract
in vivoイメージングにおける機能は、脳細胞や興味の構造の機能と生理学を研究するための強力なアプローチとなっています。最近、生物発光レポーターGFP-エクオリン（GA）を用いて、-imaging の Ca 2+新しい方法が開発されました。その補因子セレンテラジンを添加した – – 光子コレクタを介して監視することができ、明るい光を発するこの新しい技術は、カルシウムと結合することができる分子を産生する、GFPおよびエクオリン遺伝子の融合に依存しています。 GFP-エクオリン遺伝子を有するトランスジェニック系統は、マウスやショウジョウバエの両方のために生成されている。 ショウジョウバエでは、GFP-エクオリン遺伝子は、脳内の標的発現とイメージングを可能にするGAL4 / UASバイナリ発現系の制御下に置かれています。この方法は、その後に検出することが可能であることが示されている両方のCa 2+内側に-transientsとCa 2+が内部店から-released。最も重要なことは、連続記録でより長い期間を可能にする脳内の大きい深さでのイメージング、および（8.3ミリ秒まで）高時間分解能での記録。ここでは、キノコ体の中にハエの脳内の学習と記憶の中心構造をの Ca 2+ -活性を記録し、分析するために生物発光イメージングを使用するための基本的な方法を提示します。
Introduction
脳とその離散構造内の活動の基本的なパターニングおよび機能は、長い神経科学の分野内の強烈な研究分野となっています。おそらく、この問題に対処するために使用される最も初期の成功のアプローチのいくつかは、電気的活動の変化の直接的な生理学的測定した – への追加機能を持ってきた（活性のためのプロキシとして）電圧、pHまたはカルシウム濃度の変化のライブイメージングを可能にするが、代替の方法は、神経活動1の研究。イメージング技術は、減少侵襲性および全脳構造内のアクティビティを監視する能力などの利点の広い配列を運びます。また果物ショウジョウバエを飛ぶなど、扱いやすい遺伝学と動物では、そのようなカメレオン、GCaMPs、その他1と遺伝的にコードされたカルシウム指標の開発は、研究者は、単一ニューロン、ニューロン集団と脳全体を監視することができました構造。 GCaMPs（GFPはカルモジュリンに融合）またはFRET（CFPとYFPがカルモジュリンに融合された）を使用して、より伝統的な蛍光カルシウムイメージング法は、良好な空間と時間分解能を提供する有用な技術であることが証明されているが、光励起の基本プロセスは、実験的に、いくつかの制約がengendersアプリケーション。光による励起、自家蛍光、光退色、及び光毒性の性質上避けられない結果的に画像化することができる構造の深さ、記録の期間だけでなく、記録のリアルタイムの継続を制限する、製造されています。つまり、録音は、多くの場合、これらの望ましくない副作用を回避するために、断続的に実行する必要があります。
なぜなら、これらの課題の、カルシウムイメージングのさらなる代替的な方法が開発されています。最も有望な方法の一つは、カルシウムが結合した後、酵素反応によって生成される光に依存している生物発光イメージングです。 Bioluminescenトンイメージングは、光励起を必要とせず、その結果、従来のカルシウムイメージングと同じ問題が発生しません。生物発光レポーターイクオリン- オワンクラゲから分離し、λ（、GFPはまたisolated-たのと同じクラゲは、その3 EFハンド構造を経由して、カルシウムを結合し、その補因子セレンテラジンの酸化と青色光の放出をもたらす、構造変化を起こします= 469 nm）の2,3。エクオリンは、それが非常に少ないバックグラウンドノイズを生成し、細胞内カルシウム緩衝系4と干渉しないため、カルシウムトランジェントを監視することが理想的カルシウム（K dを = 10μM）に対して非常に低い親和性を有します。エクオリンは、以前にアフリカツメガエルの卵5の神経誘導の過程をモニターするために使用されてきたが生成された光は、ニューロンの活動のリアルタイムイメージングのために使用するにはあまりに暗いです。この課題、フィリップのBr＆に対処するための努力の中で＃251;てみましょうと、パスツール研究所の同僚はクラゲ4内の天然の状態を模倣する、GFPおよびエクオリン遺伝子を融合遺伝子構築物を作成しました。この融合遺伝子産物は、GFPに非放射エネルギーを転送セレンテラジンの酸化につながる構造変化を起こし、エクオリンの3 EFハンド構造を介して再びカルシウムをバインドします。代わりに、エクオリンからの青色光のGFPからの緑色光（λ= 509 nm）でのリリースでは、このエネルギー移動の結果、。 GFPとエクオリンの融合はまた、単独の4イクオリンよりも19〜65倍明るい融合タンパク質の生産の光を助けるより大きなタンパク質の安定性を付与します。脳内の生物発光のアプローチを使用すると、連続記録の期間および記録することができる脳内の構造体の数の点では両方のカルシウムイメージングの現在の実験のアプリケーションを拡張します。大まか前作の文脈では、両方のグローバルと大きいことを意味します脳の地域化「活性」の様々な（カルシウム過渡応答のプロキシを介して）監視することができます。さらに重要な活動は容易に脳における基底関数の完全な理解の追求に役立つリアルタイムかつ継続的に、より長くのために監視することができます。
ここ数年では、私たちの研究室などがバイナリ発現系の制御下でGFP-エクオリン（GAL4 / UAS-GFP-エクオリン）5,6を発現するトランスジェニックハエを開発しました。私たちは、このような香り7,8と同様に、直接ニコチンアプリケーション9によりアセチルコリン受容体刺激後のキノコ体中のCa 2+ -活性を調節する細胞成分を研究などの自然の刺激によって生産活動を記録するために、GFP-エクオリン生物発光を使用しています。また、我々はまた、長期のような以前に対処することができていない実験的な質問の数に対処するために、GFP-エクオリンを使用していました自発的カルシウムトランジェントと深い脳構造の視覚化10の撮像 。最近では、我々は、投射ニューロン（PNS）で、哺乳類のATP受容体P2X 2 11陽イオンチャネルを発現することがGAL4 / UASシステムを使用し、キノコ体（MB247-のLexA中のGFP-エクオリンを表現するのLexAシステムを使用していました13XLexAop2-IVS-G5A-BP）（B.ファイファー、Janeliaファーム、米国）の礼儀。これは、私たちは、このような匂い刺激に対する応答として、より自然条件を模倣し、今度はキノコ体（PNSの下流の標的）を活性化ATPの適用により手形債権を活性化することができました。全体的にこのP2X 2を組み合わせた技術およびGFP-エクオリンは、実験の可能性を拡張します。広義には、活動の基礎パターニングを変更することができますどのように異なる刺激と摂動についての新しい研究を開始し、より良い脳の活動のパターンを理解する機会を提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
必要に応じて、ここで紹介する最近開発された生物発光ベースのGFP-エクオリンアプローチは、Cabrero らに報告されているように腎臓星状細胞などの細胞の他の種類で、異なる神経細胞におけるCa 2+ -活性のインビボで機能的記録で可能にする、など。 2013年5。
修正、トラブルシューティング、追加のコンポーネント、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J.-R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose? J Neurogenet. 22(3), 285-307, (2008).
- Shimomura, O., & Johnson, F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75(6) 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F.H., & Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62(1), 1-8, (1963).
- Baubet, V. et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97(13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S.A., Dow, J.A.T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280(1757), 2012-2943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S.E., Daguzan, C., Moreau, M., & Miller, A.L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113(19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J.-R., Rogers, K.L., Chagneau, C., & Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2(3), e275, (2007).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., & Martin, J.-R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213(24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., Réal, E., & Martin, J.-R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105, (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., & Martin, J.-R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2(2), 0054-0068, (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M.S., & Martin, J.-R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833(7), 1632-1640, (2013).
- Lima, S.Q., & Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121(1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., & Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14(5), 373-378, (1993).
- Berridge, M.J., Bootman, M.D., & Roderick, H.L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4(7), 517-529, (2003).
- Fiala, A., & Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003(174), PL6, (2003).
- Wang, J.W., Wong, A.M., Flores, J., Vosshall, L.B., & Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112(2), 271-282, (2003).
- Wilson, R.I., Turner, G.C., & Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303(5656), 366-370, (2004).
