발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식
Summary
여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.
Abstract
생체 내 이미징 기능은 기능과 뇌 세포와 관심의 구조의 생리를 연구 할 수있는 강력한 방법이되고있다. 최근 발광 생물-GFP 리포터 쿼린 (GA)을 사용 -imaging 칼슘의 새로운 방법이 개발되었다. 그 팩터 코 엘렌 테라의 첨가 – – 광자 수집기를 통해 모니터링 할 수 밝은 발광을이 새로운 기술은 칼슘과 결합 할 수있는 분자의 제조, 및 GFP 쿼린 유전자 융합에 의존한다. GFP-쿼린 유전자를 운반하는 형질 전환 계통은 마우스 및 초파리 모두에 대해 생성되었다. 초파리, GFP-쿼린 유전자는 뇌 내에서 표적 발현 및 이미징을 허용 GAL4 / UAS 진 발현 시스템의 통제하에 놓여있다. 이 방법은 연속적으로 검출 할 수있는 것으로 나타났습니다 모두 칼슘 안쪽 2+ -transients과 칼슘은 내 상점에서 -released. 가장 중요한 점은 연속 촬영, 뇌 내에서 더 깊이에서 영상에 더 큰 기간 동안 허용하고, (8.3 밀리 초까지) 높은 시간 해상도로 기록. 여기에서 우리는 기록하고 칼슘에게 버섯 기관 내에서 2 + -activity, 플라이 뇌의 학습과 기억의 중심 구조를 분석하는 생물 발광 영상을 사용하기위한 기본적인 방법을 제시한다.
Introduction
기본적인 패턴과 뇌와 분리 된 구조 내에서 활동의 기능은 긴 신경 과학 분야 내에서 강렬한 연구의 영역이었다. 아마도 이러한 문제를 해결하는 데 이른 성공적인 방법 중 일부는 전기적 활성도의 변화를 직접 생리적 측정 하였다 -에 추가 기능을 가져왔다 (활동 프록시와 같은) 전압의 pH 또는 칼슘 농도의 변화의 라이브 영상을 허용하지만 다른 방법은 신경 활동 1의 연구. 이미징 기술은 감소 된 침습성 및 뇌 전체 구조물 내에 활동을 모니터하는 등의 장점을 가지고 다양한. 또한 과일을 포함하여 다루기 쉬운 유전학과 동물에 초파리, 같은 카멜레온, GCaMPs 등과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표의 개발을 비행 한 단일 신경 세포, 신경 세포의 인구 및 전체 뇌를 모니터링하는 연구를 허용 한구조. 전통적인 형광 칼슘 이미징 방법 (칼 모듈 린에 융합 CFP와 YFP) (칼 모듈 린에 융합 GFP) 또는 FRET을 GCaMPs를 사용하는 동안 좋은 공간 및 시간 해상도를 제공하는 유용한 기술을 입증 한 빛 여기의 기본 프로세스는 실험에 몇 가지 제한을 낳는다 응용 프로그램. 이에 의한 묘화 될 수 구조물의 깊이를 제한 불가피하게 생성되는 여기 광, 형광도, 광 표백제 및 광독성의 특성에, 녹화 시간뿐만 아니라 기록 실시간 연속성. 즉, 이러한 기록은 종종 바람직하지 않은 부작용을 방지하기 위해 간헐적으로 수행되어야한다.
이러한 어려움 때문에, 칼슘의 이미징 추가적인 다른 방법이 개발되었다. 가장 유망한 방법 중 하나는 칼슘 결합 후 효소 반응을 통해 제조 된 광 생물 발광 이미징에 의존한다. BioluminescenT 영상은 기존의 칼슘 이미징과 같은 문제가 발생하지 않습니다 결과적으로 빛 자극을 필요로하지 않습니다. 발광 생물 기자 쿼린 – 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 격리 λ (GFP는 isolated-되었던 같은 해파리는 세 EF 손 구조를 통해 칼슘을 결합하여 그 보조 인자의 코 엘렌 테라의 산화와 푸른 빛의 방출로 이어지는 구조적인 변화를 겪게 = 469 ㎚) 2,3. 에 쿼린은 거의 배경 잡음을 생성 및 세포 내 칼슘 버퍼링 시스템 (4)과 간섭하지 않기 때문에 칼슘 과도 모니터링 이상적 칼슘 (K의 D = 10 μM)에 대한 매우 낮은 친화도를 갖는다. 쿼린 나란히 Xenopus의 달걀 5 제조 비추어 신경 유도의 과정을 모니터링하는 데 사용되었지만, 신경 세포 활성도의 실시간 영상에 사용하기에 너무 희미하다. 이 도전 필립 브롬 및 해결하기위한 노력# 251; 파스퇴르 연구소의하자 동료들은 해파리 4에서 기본 상태를 모방, GFP 융합 유전자를 쿼린 유전자 구조를 만들었습니다. 이 융합 유전자 생성물은 GFP에 비방 에너지 전송 엘렌 테라, 산화 선도 형태 적 변화를 겪게 쿼린의 세 EF 손 구조를 통해 다시 칼슘을 결합한다. 대신 쿼린에서 푸른 빛의 GFP에서 녹색 빛 (λ = 509 ㎚)의 릴리스에서이 에너지 전달의 결과. GFP 및 쿼린의 융합은 혼자 4 쿼린보다 19-65 배 더 밝은 융합 단백질 생산 등을 돕는 큰 단백질의 안정성을 부여한다. 뇌 내의 생물 발광 방식을 사용하는 것은 연속적인 기록 기간 및 기록 할 수있다 뇌 내의 구조의 수의 관점에서 모두 칼슘 이미징 실험의 전류 프로그램을 확장한다. 대체로 기존 연구의 맥락에서 그것은 그 두 세계와 더 큰 의미뇌의 지역화 "활동"의 다양한 (칼슘 과도의 프록시를 통해) 모니터링 할 수 있습니다. 더 중요한 활성 용이 뇌 기저 함수의 완전한 이해를 추구라는 것으로 실시간으로 지속적에서는 이상을 감시 할 수있다.
지난 몇 년간, 본 연구실 및 다른 바이너리 발현 시스템의 통제하에 GFP-쿼린 (GAL4 / UAS-GFP-쿼린) -5,6- 발현 형질 전환 초파리을 개발 하였다. 우리는 직접 니코틴 응용 프로그램 (9)에 의해 아세틸 콜린 수용체 자극 다음 버섯 몸에 칼슘 -activity 변조 등의 향기 7, 8 등의 천연 자극뿐만 아니라 공부 세포 성분에 의해 생성 된 기록 활동에 GFP – 쿼린 생물 발광을 사용했습니다. 또한, 우리는 또한 장기간 같은 이전 해결 될 수 없었다 실험 질문들을 해결하기 위해 GFP-쿼린을 사용한자연 칼슘 과도 깊은 뇌 구조 (10)의 시각화의 영상. 더 최근에, 우리는 포유류 ATP 수용체 P2X 2 11 프로젝션 뉴런 양이온 채널 (PN 수)를 표현하는 GAL4 / UAS 시스템을 사용하고 (MB247-LEXA를 버섯 체에서 GFP-쿼린을 표현 LEXA 시스템을 사용한, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. 파이퍼, Janelia 농장, 미국)의 의례. 이것은 우리가 같은 냄새 자극에 대한 반응으로 자연 조건을 모방 차례로 버섯 기관 (PN이의 다운 스트림 대상)를 활성화 ATP의 응용 프로그램에 의해 PN을 활성화 할 수있다. 전반적으로이 P2X이 결합 기술과 GFP – 쿼린은 실험 가능성을 확장합니다. 넓게는 다른 자극과 섭동 활동의 기저 패턴을 변경할 수있는 새로운 방법에 대한 연구를 시작,보다 뇌 활동의 패턴을 이해할 수있는 기회를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cabrero 등의 알에보고 여기에 제시된 최근에 개발 된 생물 발광 기반 GFP – 쿼린 접근 방식은 신장 별 모양의 세포와 같은 세포의 다른 종류뿐만 아니라 원하는 것처럼, 다른 신경 세포에 칼슘 -activity의 생체 내 기능을 녹음 할 수 있습니다. 2013 년 5.
수정, 문제점 해결, 추가 구성 요소, 그리고 중요한 단계
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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