En Vivo Cerebral Funcional Imaging Enfoque Basado en calcio bioluminiscente Indicador GFP-aequorina
Summary
Aquí presentamos una novela Ca 2+ -Imagenología enfoque utilizando un reportero bioluminiscente. Este método utiliza una construcción GFP-aequorina fundida que se une a Ca 2+ y emite luz, eliminando la necesidad de excitación luz. Significativamente este método permite la proyección de imagen continua de largo, el acceso a las estructuras cerebrales profundas y alta resolución temporal.
Abstract
Funcional de imágenes in vivo se ha convertido en un enfoque poderoso para estudiar la función y la fisiología de las células y estructuras de interés del cerebro. Recientemente, un nuevo método de Ca 2+ -Imagenología usando el reportero bioluminiscente GFP-aequorina (GA) se ha desarrollado. Esta nueva técnica se basa en la fusión de los genes GFP y aequorina, produciendo una molécula capaz de unirse calcio y – con la adición de su cofactor coelenterazina – emisor de luz brillante que se puede controlar a través de un colector de fotones. Las líneas transgénicas que llevan el gen GFP-aequorina se han generado para ambos ratones y Drosophila. En Drosophila, el gen GFP-aequorina se ha colocado bajo el control del sistema de expresión binario GAL4 / UAS permite la expresión específica y de formación de imágenes dentro del cerebro. Este método ha sido posteriormente demostrado ser capaz de detectar tanto hacia el interior Ca 2 + -transitorios y Ca 2+ -released de las tiendas interiores. Lo más importante es que permite una mayor duración en la grabación continua, de formación de imágenes a mayor profundidad dentro del cerebro, y la grabación en altas resoluciones temporales (hasta 8,3 mseg). Aquí presentamos el método básico para el uso de imágenes bioluminiscente para registrar y analizar Ca 2+ -Actividad dentro de los órganos de setas, una estructura central para el aprendizaje y la memoria en el cerebro de la mosca.
Introduction
El patrón y la función de la actividad dentro del cerebro y sus estructuras discretas fundamental han sido durante mucho tiempo un área de intenso estudio en el campo de la neurociencia. Tal vez algunos de los enfoques exitosos primeros utilizados para tratar este tema eran medición fisiológica directa del cambio en la actividad eléctrica – métodos embargo alternativos que permiten imágenes en vivo de los cambios en las concentraciones de tensión, de pH o calcio (como sustituto de la actividad) han traído capacidades adicionales a el estudio de la actividad neuronal 1. Las técnicas de imagen tienen una amplia gama de ventajas tales como la reducción de la invasividad y la capacidad de monitorear la actividad dentro de las estructuras cerebrales enteros. Además, en animales con genética tratables como la mosca de la fruta Drosophila, el desarrollo de indicadores de calcio codificados genéticamente, como cameleon, GCaMPs y otros 1 han permitido a los investigadores para supervisar las neuronas individuales, poblaciones neuronales y todo el cerebroestructuras. Mientras que los métodos más tradicionales fluorescentes Imagen de calcio utilizando GCaMPs (GFP fusionada a calmodulina) o FRET (PPC y YFP fusionado a calmodulina) han demostrado ser técnicas útiles que proporcionan una buena resolución espacial y temporal, el proceso subyacente de la excitación de luz genera algunas limitaciones en su experimental aplicaciones. Debido a la naturaleza de la excitación de luz, autofluorescencia, foto-blanqueo, y fototoxicidad se producen inevitablemente, que en consecuencia limita la profundidad de las estructuras que se pueden obtener imágenes, la duración de las grabaciones, así como la continuidad en tiempo real de grabación. En otras palabras, a menudo grabaciones deben realizarse intermitentemente para evitar estos efectos secundarios no deseados.
Debido a estos problemas, se han desarrollado métodos alternativos adicionales de imágenes de calcio. Uno de los métodos más prometedores es bioluminiscente de imágenes, que se basa en la luz producida a través de una reacción enzimática después de la unión de calcio. Bioluminescent de imagen no requiere de excitación de luz y por lo tanto no experimenta las mismas dificultades que imágenes de calcio convencional. El reportero Aequorina bioluminiscente – aislada de Aequorea victoria, el mismo medusas GFP a partir del cual también fue isolated- se une al calcio a través de sus tres estructuras de mano EF y sufre un cambio conformacional, que conduce a la oxidación de su cofactor coelenterazina y la liberación de la luz azul (λ = 469 nm) 2,3. Aequorina tiene una afinidad muy baja para el calcio (K d = 10 mM) que lo hace ideal para el seguimiento de los transitorios de calcio, ya que produce muy poco ruido de fondo y no interfiere con el sistema de tamponamiento de calcio intracelular 4. Aunque ecuorina se ha utilizado anteriormente para controlar el proceso de inducción neural en el huevo Xenopus 5 la luz producida es demasiado tenue para usar para formación de imágenes en tiempo real de la actividad neuronal. En un esfuerzo por abordar este desafío, Philippe Br y# 251; dejar y sus colegas del Instituto Pasteur creó una construcción genética fusión GFP y aequorina genes, imitando el estado nativo dentro de la medusa 4. Este producto gen de fusión se une al calcio nuevo a través de las tres estructuras de mano EF de aequorina, que sufre un cambio conformacional que conduce a la oxidación de la coelenterazina, que transfiere energía no radiativamente a la GFP. Esta transferencia de energía como resultado la liberación de la luz verde (λ = 509 nm) a partir de las buenas prácticas agrarias, en lugar de la luz azul de aequorina. La fusión de las buenas prácticas agrarias y aequorina también confiere una mayor estabilidad de la proteína ayuda a la proteína de fusión producen luz de 19 a 65 veces más brillante que aequorina solo 4. Utilizando un enfoque bioluminiscente en el cerebro se expande la aplicación experimental actual de imágenes de calcio tanto en términos de la duración de la grabación continua y el número de estructuras dentro del cerebro que se puede grabar. En términos generales, en el contexto del trabajo anterior significa que tanto global y una mayorvariedad de "actividad" regionalizado del cerebro puede ser monitorizado (a través del proxy de los transitorios de calcio). Más importante actividad se puede controlar por más tiempo, en un tiempo real y de forma continua, lo que se presta fácilmente a la búsqueda de una comprensión más completa de la función basal en el cerebro.
En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado moscas transgénicas que expresan la GFP-aequorina bajo el control del sistema de expresión binario (GAL4 / UAS-GFP-aequorina) 5,6. Hemos utilizado la bioluminiscencia-GFP aequorina para registrar la actividad producida por estímulos naturales tales como aroma 7,8, así como los componentes celulares estudiadas modulan Ca 2+ -Actividad en los cuerpos de hongos siguientes estimulación del receptor de acetilcolina nicotínico mediante la aplicación directa 9. Además, también hemos utilizado GFP-aequorina hacer frente a una serie de preguntas experimentales que no han podido ser tratados previamente, como a largo plazoimágenes de los transitorios de calcio espontáneas y visualización de las estructuras cerebrales profundas 10. Más recientemente, se ha utilizado el sistema GAL4 / UAS para expresar el receptor de mamífero ATP P2X 2 11 un canal de cationes, en las neuronas de proyección (PN) y se utiliza el sistema LexA expresar GFP-aequorina en los órganos de setas (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (cortesía de B. Pfeiffer, Janelia Granja, EE.UU.). Esto nos ha permitido activar el PN por aplicación de la ATP, que a su vez activa los órganos de setas (una diana aguas abajo de la PN), imitando las condiciones más naturales, como la respuesta a un estímulo olor. En general esta técnica que combina P2X 2 y GFP-aequorina amplía las posibilidades de experimentación. En términos generales, ofrece la oportunidad de entender mejor los patrones de actividad en el cerebro, la iniciación de nuevos estudios sobre cómo los diferentes estímulos y las perturbaciones pueden alterar el patrón basal de actividad.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque-GFP-aequorina bioluminiscente basado recientemente desarrollado que aquí se presenta permite la grabación funcional in vivo de Ca 2+ -Actividad en diferentes neuronas en, así como si se desea, en otro tipo de células, tales como células estrelladas del riñón como se informa en Cabrero et al. , 2013 5.
Modificaciones, solución de problemas, componentes adicionales y pasos críticos
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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