Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em> Plasmodium</em> Sporozoiten
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Malaria – Infektion beginnt , wenn die Sporozoiten – Stadium von Plasmodium in die Haut eines Säugerwirt durch einen Mückenstich beimpft. Der hoch motile Parasit nicht erreicht nur die Leber Hepatozyten einzudringen und in Erythrozyten-infektiöse Form verwandeln. Es wandert auch in die Haut und zum proximalen Lymphknoten die Injektionsstelle Entwässern, wo sie von resident und / oder rekrutiert myeloischen Zellen erkannt und abgebaut werden können. Intravital Imaging berichtet die frühe Rekrutierung von hell fluoreszierende Lys-GFP positiven Leukozyten in der Haut und den Wechselwirkungen zwischen Sporozoiten und CD11c + Zellen im Lymphknoten. Wir präsentieren hier ein effizientes Verfahren zu erholen, zu identifizieren und die myeloischen Zelluntergruppen aufzuzählen, die auf die Haut von Mäusen angeworben werden und ableitenden Lymphknoten folgende intradermale Injektion von Dosen von Sporozoiten in einem Mausmodell immunisieren. Phänotypischen Charakterisierung mittels Multi-parametrischer Durchflusszytometrie bietetein zuverlässiger Assay frühen dynamischen zellulären Veränderungen bei entzündlichen Reaktion auf Plasmodium – Infektion zu bewerten.
Introduction
Malaria ist eine der tödlichsten Infektionskrankheiten der Welt, mehr als eine halbe Million Menschen pro Jahr töten. Infektionen durch Plasmodium, dem Erreger der Krankheit beginnt mit einem vorge erythrozytären (PE) -Phase. Während dieser Phase in die Wirts Haut von einer Mücke weiblichen Anopheles injiziert Sporozoiten erreichen die Leber über die Blutbahn und im Inneren Hepatozyten in die Parasitenformen unterscheiden , die roten Blutkörperchen infizieren und bewirken , dass die Symptome der Krankheit.
Die PE – Stadien von Plasmodium stellen eine privilegierte Ziel für Anti-Malaria – Impfung. Tatsächlich abgeschwächten Lebendimpfstoffe gegen diesen Phasen, wie Strahlung abgeschwächt Sporozoiten (RAS), genetisch verhaftet Parasiten (GAP) oder Chemoprophylaxe und Sporozoiten (CPS) haben ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt 1-9 sowohl Nagetier und menschlichen Wirten zu schützen. Im Nagetiermodell sind die meisten Impfung Studien intravenöse Immunisierung unter Verwendung von, Das ist der Goldstandard in Bezug auf die Schutzwirkung. Allerdings hat die Beschreibung einer Haut Stufe und die Bedeutung der Haut-assoziierten Lymphknoten (dLN) bei der Auslösung Schutz unserer Wahrnehmung der PE-Phase geändert und betonte die Bedeutung der intradermale Route der Injektion. Intravital Bildgebung von P. berghei – Sporozoiten in die Haut von Nagetieren injiziert hat gezeigt , dass nur ~ 25% des Inokulums über die Blutbahn in die Leber gelangt. Die verbleibende ~ 75% verteilt sich zwischen dem proximalen dLN (~ 15%) und der Haut (~ 50%) 10,11, wo ein kleiner Anteil verwandeln und am Leben bleiben über Wochen Innenhautzellen 12,13. Außerdem beschrieben nachfolgende Studien , dass die Schaffung von wirksamen Schutzimmunität nach intradermale Immunisierung vor allem in der Haut-dLN nimmt, wo Parasiten spezifischen CD8 + T – Zellen aktiviert werden, und nur geringfügig in der Milz oder Leber-DLNs 14,15.
Währenddie meisten Studien haben sich auf die Charakterisierung der Effektor-Zellen in der Einrichtung protektive Immunantwort beteiligt konzentriert, noch viel weniger wird über das Schicksal von lebenden attenuierten Parasiten in die Haut injiziert bekannt, insbesondere ihre Wechselwirkungen mit dem angeborenen Immunsystem. Insbesondere Charakterisierung von Antigen-präsentierenden in Parasit – Antigen – Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation für CD8 + T – Zellen beteiligten Zellen ist von entscheidender Bedeutung, zu wissen , dass Akquisitions PE Antigen sowohl in der Haut und dLN Kompartimente auftreten können. Zurück intravital Bildgebungsstudien beschrieben einen frühen Zustrom von hell fluoreszierende Lys-GFP – positiven Zellen in der Haut nach einem infektiösen Mückenstich 16 , während frühe Interaktionen zwischen Sporozoiten und dendritischen Zellen wurden in der dLN 10,17 beobachtet. In jüngerer Zeit hat es sich durch Mücken in der Haut inokuliert Sporozoiten erhöht die Beweglichkeit der beiden dendritischen und regulatorische T-Zellen in der Haut berichtet, dassMäuse, während eine Abnahme Anzahl von Antigen – präsentierenden Zellen in der dLN 18 beobachtet.
Wir sollen , zu identifizieren und genauer die Leukozytenuntergruppen rekrutiert in der Haut und entsprechenden dLN sowie diejenigen mit dem Parasiten zu quantifizieren 19 folgende intradermale Injektion von immunisierenden Dosen von RAS zu interagieren. In diesem Zusammenhang isolierten wir myeloiden Zellen (CD45 + CD11b +) von beiden Geweben und gekennzeichnet Subpopulationen von Interesse durch Mehr = parametrischer Durchflusszytometrie. In Übereinstimmung mit der Immunantwort in der frühen Phase der Haupt Leishmania beschrieben Infektion der Haut 20, die primäre Wirtsantwort Injektion Sporozoiten besteht aus einer aufeinanderfolgenden Einstellung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) , gefolgt von inflammatorischen Monozyten (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) , die auf der Basis von differenti identifiziertal Expression der Ly6G und Ly6C Oberflächenmarker.
Wir beschreiben hier ein Protokoll für die myeloischen Zellen aus der Haut von Mäusen zu isolieren und dLN folgende intradermale Injektion von infizierten Mücke Speicheldrüsen extrahiert Dosen von RAS immunisieren. Reproduzierbare intradermale Injektionen und Gewebeverarbeitung sind wichtige Schritte phänotypischen Veränderungen infiltrieren Zellpopulation innerhalb infizierten Geweben zu quantifizieren. Der Ansatz detailliert unten stellt einen zuverlässigen Assay die Haut und dLN entzündliche Reaktion auf Plasmodium Parasiten zu bewerten und kann auf verschiedene experimentelle Systeme erweitert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Perspektive von großen Impfung von Menschen eine ganze Sporozoiten – Impfstoff gegen Malaria verwendet, einer der wichtigsten Herausforderungen zu überwinden , ist es , optimierte Routen und Methoden der Parasit Verabreichung entwickeln erfolgreiche Immunisierung und Schutz 24,25 zu gewährleisten. Beim Menschen hat die Bewertung der Schutzwirkung vermittelt durch lebende , abgeschwächte Parasiten (LAP) nach Natur Mücke durchgeführt worden beißt 2 sowie intradermale, subkutane 25,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Patricia Baldacci, Vanessa lagal und Sabine Thiberge für das kritische Lesen, Irina Dobrescu und Sabine Thiberge um Hilfe in Bildern und Pauline Formaglio für den Unterricht in – vivo – Bildgebung von Sporozoiten – Motilität in der Mäusehaut nehmen. Wir möchten auch Marek Szatanik und das Zentrum für Produktion und Infektion von Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) für Mückenzucht zu danken. Diese Studie wurde von der AXA Research Fund und Mittel aus dem Laboratoire d'Excellence "Integrative Biologie der Emerging Infectious Diseases" unterstützt (Förder-Nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
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