El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em> Plasmodium</emLos esporozoitos>
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Infección de la malaria comienza cuando la fase de esporozoito de Plasmodium se inocula en la piel de un huésped mamífero a través de una picadura de mosquito. El parásito muy móviles no sólo llega al hígado a invadir hepatocitos y transformar en forma globular-infeccioso. También migra en la piel y a los ganglios linfáticos de drenaje proximal del sitio de inyección, en los que puede ser reconocido y degradado por residentes y / o células mieloides reclutados. Intravital de imágenes informó el reclutamiento temprano de brillantemente fluorescente Lys-GFP leucocitos positivos en la piel y las interacciones entre los esporozoitos y CD11c + células en el ganglio linfático de drenaje. Presentamos aquí un procedimiento eficaz para recuperar, identificar y enumerar los subconjuntos de células mieloides que son reclutados a la piel del ratón y drenan los ganglios linfáticos después de la inyección intradérmica de inmunización de dosis de esporozoitos en un modelo murino. Caracterización fenotípica utilizando el flujo multi-paramétrico proporciona citometríaun ensayo fiable para evaluar los cambios celulares tempranos dinámicos durante la respuesta inflamatoria a la infección por Plasmodium.
Introduction
La malaria es una de las enfermedades infecciosas más mortales en el mundo, matando a más de medio millón de personas por año. La infección por Plasmodium, el agente causal de la enfermedad, comienza por una fase pre-eritrocítica (PE). Durante esta fase, los esporozoitos inyectados en la piel de acogida por un mosquito anófeles hembra llegan al hígado a través del torrente sanguíneo y se diferencian los hepatocitos dentro en las formas de parásitos que infectan a las células rojas de la sangre y causan los síntomas de la enfermedad.
Las etapas de educación física de Plasmodium representan un objetivo privilegiado para la vacunación contra la malaria. De hecho, las vacunas vivas atenuadas contra estas etapas, tales como esporozoitos atenuados por radiación (RAS), parásitos detenidos genéticamente (BPA) o quimioprofilaxis y esporozoitos (CPS) han demostrado su capacidad para proteger tanto a los roedores y humanos anfitriones 1-9. En el modelo de roedores, se llevan a cabo la mayoría de los estudios de vacunación utilizando la inmunización por vía intravenosa, Que es el estándar de oro en términos de eficacia protectora. Sin embargo, la descripción de una etapa de la piel y la importancia de los ganglios linfáticos de la piel asociada de drenaje (DLN) en la obtención de la protección ha cambiado nuestra percepción de la fase de PE y enfatizó la importancia de la vía intradérmica de la inyección. Intravital de imágenes de P. esporozoitos berghei inyecta en la piel de los roedores se ha demostrado que sólo ~ 25% del inóculo llega al hígado a través del torrente sanguíneo. El restante 75% ~ distribuye entre el DLN proximal (~ 15%) y la piel (~ 50%) 10,11, donde una pequeña proporción puede transformar y permanecer con vida durante semanas dentro de las células de la piel 12,13. Por otra parte, los estudios posteriores describen que el establecimiento de la inmunidad protectora eficaz después de la inmunización intradérmica se realiza principalmente en la piel-DLN, donde se activan las células T CD8 + específicas del parásito, y sólo de forma marginal en el bazo o del hígado-dLNs 14,15.
Mientrasla mayoría de los estudios se han centrado en la caracterización de las células efectoras implicadas en el establecimiento de la respuesta inmune protectora, se sabe mucho menos sobre el destino de parásitos vivos atenuados inyectados en la piel, especialmente sus interacciones con el sistema inmune innato. En particular, la caracterización de las células presentadoras de antígenos que participan en la absorción de antígeno del parásito, el procesamiento y la presentación a las células T CD8 + es de importancia crítica, sabiendo que la adquisición antígeno PE puede ocurrir tanto en la piel y compartimentos DLN. Anteriores estudios de imagen intravital describen una afluencia temprana de las células fluorescentes brillantes Lys-GFP positivas en la piel después de una picadura de un mosquito infectado 16, mientras que se observaron las primeras interacciones entre los esporozoitos y las células dendríticas en el DLN 10,17. Más recientemente, se ha informado de que los esporozoitos inoculados en la piel por los mosquitos aumenta la motilidad de tanto las células T reguladoras dendríticas y en la piel delos ratones, mientras que se observó una disminución del número de células presentadoras de antígenos en el DLN 18.
El objetivo fue identificar y cuantificar con más precisión los subconjuntos de leucocitos reclutados en la piel y los correspondientes DLN, así como aquellos que interactúan con el parásito después de la inyección intradérmica de la inmunización de dosis de RAS 19. En este contexto, aislamos células mieloides (CD45 + CD11b +) de ambos tejidos y caracterizado subpoblaciones de interés por el multi = flujo paramétrico citometría. De acuerdo con la respuesta inmune se describe en la etapa temprana de Leishmania major infección de la piel 20, la respuesta del huésped primario a esporozoitos de inyección consta de un reclutamiento sucesiva de los neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguidos de monocitos inflamatorios (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) que se identifican sobre la base de Differential expresión de los marcadores de superficie Ly6G y Ly6c.
Se describe aquí un protocolo para el aislamiento de células mieloides de la piel del ratón y DLN después de la inyección intradérmica de la inmunización de dosis de RAS extraídos de las glándulas salivales de mosquitos infectados. inyecciones intradérmicas reproducibles y procesamiento de tejidos son pasos críticos para cuantificar los cambios fenotípicos de infiltrarse en la población de células dentro de los tejidos infectados. El enfoque se detalla a continuación proporciona un ensayo fiable para evaluar la piel y la respuesta inflamatoria DLN a Plasmodium parásito y se puede extender a varios sistemas experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la perspectiva de la vacunación a gran escala de los seres humanos con una vacuna entera malaria esporozoitos, uno de los principales retos a superar es el desarrollo de rutas y métodos de administración parásito optimizadas para asegurar la inmunización y protección 24,25 exitosa. En los seres humanos, la evaluación de la eficacia protectora mediada por parásitos vivos atenuados (LAP) ha llevado a cabo siguiendo natural de mosquitos muerde 2, así como intradérmica, subcutánea 25…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Patricia Baldacci, Vanessa lagal y Sabine Thiberge para la lectura crítica, Irina Dobrescu y Sabine Thiberge en busca de ayuda en la toma de fotografías y Pauline Formaglio para la enseñanza de imágenes in vivo de la motilidad esporozoito en la piel del ratón. También nos gustaría dar las gracias a Marek Szatanik y el Centro de Producción e infección de Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para la cría de mosquitos. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación AXA y fondos del Laboratoire d'Excellence "Biología Integrativa de Emerging Infectious Diseases" (concesión no. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
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