弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em>マラリア原虫</em>スポロゾイト
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
マラリア原虫のスポロゾイト段階は、蚊に刺さを介して哺乳動物宿主の皮膚に接種されたときにマラリア感染が開始されます。非常に運動性の寄生虫は、肝細胞に侵入し、赤血球感染形式に変換するための肝臓に到達していないだけ。それはまた、皮膚に、それが認識され、居住者及び/又は動員骨髄系細胞によって分解することができる注射部位を、排出近位リンパ節に移動します。生体内イメージングは、明るい蛍光のLys-GFP陽性の皮膚中の白血球および排出リンパ節におけるスポロゾイトおよびCD11c +細胞間の相互作用の早期動員を報告しました。ここでは、回復特定し、マウスの皮膚に動員し、マウスモデルにおいてスポロゾイトの投与量を免疫の皮内注射後のリンパ節を排出している骨髄細胞サブセットを列挙するための効率的な手順を提示します。表現型の特徴用いたマルチパラメトリックフローサイトメトリー提供しますマラリア原虫感染に対する炎症反応の初期にダイナミックな細胞変化を評価するための信頼性の高いアッセイ。
Introduction
マラリアは年間50万人以上を殺害し、世界最悪の感染症の一つです。 マラリア原虫 、疾患の原因物質による感染は、前赤血球（PE）相によって開始されます。このフェーズでは、雌ハマダラカ蚊によって宿主の皮膚に注入されたスポロゾイトは、血流を介して肝臓に到達し、赤血球に感染し、疾患の症状を引き起こす寄生形態に内部に肝細胞を区別する。
マラリア原虫のPE段は、抗マラリアワクチン接種のための特権標的を表します。実際、このような放射線弱毒化スポロゾイト（RAS）などのこれらのステージに対する弱毒化ワクチンを、生きて、遺伝的に逮捕された寄生虫（GAP）または化学的予防及びスポロゾイト（CPS）は、げっ歯類とヒト宿主1-9の両方を保護する能力を実証しています。齧歯類モデルでは、ほとんどのワクチン接種研究は、静脈内免疫を利用して行われます、防御効力の点でゴールドスタンダードです。しかし、皮膚のステージの説明と保護を誘発するのに皮膚関連の流入領域リンパ節（DLN）の重要性は、PE相の私達の認識を変え、注入の皮内経路の重要性を強調しています。 P.の生体内イメージングげっ歯類の皮膚に注入ベルゲイのスポロゾイトは、接種物のみ〜25％が血流を介して肝臓に到達したことを示しています。残りの〜75％は、近位DLN（〜15％）と少量変換し、皮膚細胞12,13の内側週間生きている残ることができる皮膚（〜50％）10,11、の間で分配します。また、その後の研究は、皮内免疫化後の効果的な防御免疫の確立は、主に寄生虫特異的CD8 + T細胞が14,15脾臓または肝臓-dLNsにわずかしか活性化され、皮膚DLNに起こることを説明しました。
同時にほとんどの研究は、はるかに少ない皮膚に注入生きた弱毒寄生虫、先天性免疫系との特にそれらの相互作用の運命について知られている、防御免疫応答の確立に関与するエフェクター細胞の特徴付けに集中しています。具体的には、CD8 + T細胞への寄生虫抗原取り込み、プロセシングおよび提示に関与する抗原提示細胞の特徴付けは、PE抗原捕捉は、皮膚及びDLNコンパートメントの両方において発生する可能性があることを知って、非常に重要です。前の生体内イメージング研究は、スポロゾイトと樹状細胞との間の初期の相互作用がDLN 10,17で観察された感染蚊に刺され16次肌に明るい蛍光のLys-GFP陽性細胞の早期流入を説明しました。より最近では、蚊によって皮膚に接種スポロゾイトは、皮膚の両方の樹状細胞および制御性T細胞の運動性を増大させることが報告されていますマウスを、抗原提示細胞の減少数は、DLN 18で観察されました。
我々は、白血球の皮膚とそれに対応するDLNで募集サブセットだけでなく、RAS 19の用量を免疫の皮内注射後の寄生虫と相互作用するものを同定し、より正確に定量化することを目的としました。この文脈において、我々は両方の組織から骨髄細胞（CD45 +のCD11b +）を単離し、マルチ=パラメトリックフローサイトメトリーによって関心の亜集団を特徴とします。 リーシュマニアの主要な皮膚感染20の初期の段階で説明した免疫応答と一致して、注射をスポロゾイトする主な宿主応答は、炎症性単球（CD45 +のCD11b続い多形核好中球（CD45 +のCD11b + Ly6G + Ly6C int型 ）の連続した募集で構成されてい+ Ly6G – differentiに基づいて識別されているLy6C +）Ly6GおよびLy6C表面マーカーのアル表現。
ここでは、感染した蚊の唾液腺から抽出されたRASの用量を免疫の皮内注射後のマウスの皮膚とDLNから骨髄細胞を単離するためのプロトコルについて説明します。再現性の皮内注射し、組織処理は、感染組織内の細胞集団を浸潤の表現型の変化を定量化するための重要なステップです。以下に詳述するアプローチは、皮膚やマラリア原虫にDLN炎症反応を評価するための信頼性の高いアッセイを提供し、様々な実験系に拡張することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
全スポロゾイトマラリアワクチンを用いたヒトの大規模なワクチン接種の観点では、克服すべき主な課題の一つは、成功した免疫化および保護24,25を確実にするために最適化された経路および寄生虫投与方法を開発することです。ヒトでは、生きた弱毒寄生虫（LAP）によって媒介される防御効果の評価は、自然蚊に刺さ2と同様に、皮内、皮下25,26およびIV免疫化の2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マウスの皮膚におけるスポロゾイトの運動性のin vivoイメージングに教えるためのパトリシアBaldacci、ヴァネッサLagalとザビーネThiberge重要な読書のために、イリーナDobrescuとザビーネThiberge写真を撮るのヘルプおよびポーリンFormaglioに感謝します。また、蚊の飼育のための生産とハマダラカ（CEPIA-パスツール研究所）の感染のためにマレックSzatanikとセンターに感謝したいと思います。この研究は、ラボラトリードール・エクセレンス "新興感染症の統合生物学」（無許可。ANR-10-LABX-62-IBEID）からAXAリサーチファンドと資金によってサポートされていました。
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
References
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