Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli
Summary
Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.
Abstract
Il pesce Spinarello è emersa come un potente sistema per studiare la base genetica di una vasta gamma di morfologica, fisiologica, e fenotipi comportamentali. I fenotipi notevolmente diverse che si sono evoluti come le popolazioni marine si adattano agli ambienti di acqua dolce innumerevoli, combinata con la capacità di attraversare le forme marine e d'acqua dolce, forniscono un sistema di vertebrati raro in cui la genetica può essere utilizzato per mappare regioni genomiche il controllo sia evoluto tratti. Eccellenti risorse genomiche sono ora disponibili, facilitando molecolare dissezione genetica dei cambiamenti evoluti. Mentre gli esperimenti di mappatura generano liste di geni candidati interessanti, manipolazioni genetiche funzionali sono necessari per testare il ruolo di questi geni. regolazione genica può essere studiato con plasmidi reporter transgenici e BAC integrate nel genoma utilizzando il sistema trasposasi Tol2. Funzioni di specifici geni candidati e gli elementi -regulatory cis possono essere valutate inducendo miratamutazioni con Talen e CRISPR / Cas9 reagenti modifica del genoma. Tutti i metodi richiedono l'introduzione di acidi nucleici in fecondate embrioni spinarello un cellulare, un compito reso difficile dalla fitta corion di embrioni stickleback e il relativamente piccolo e sottile blastomeri. Qui, un protocollo dettagliato per la microiniezione di acidi nucleici in embrioni spinarello è descritto per le applicazioni transgeniche e la modifica del genoma per studiare l'espressione genica e la funzione, così come le tecniche per valutare il successo di transgenesi e recuperare le linee stabili.
Introduction
Una componente fondamentale di capire come la biodiversità si pone è la determinazione delle basi genetiche e di sviluppo dei cambiamenti fenotipici evoluti in natura. Il pesce Spinarello, Gasterosteus aculeatus, è emerso come un ottimo modello per studiare le basi genetiche dell'evoluzione. Spinarelli hanno subito molti cambiamenti evolutivi adattativi come i pesci marini hanno colonizzato gli ambienti di acqua dolce innumerevoli intorno nell'emisfero settentrionale, con conseguente morfologica drammatico, fisiologici, e cambiamenti comportamentali 1. I genomi di individui di ventuno popolazioni stickleback sono stati sequenziati e assemblati, e una mappa linkage alta densità è stato generato per migliorare ulteriormente il gruppo 2,3. Esperimenti di mappatura genetici hanno identificato regioni genomiche sottostante fenotipi evoluti 4 – 6, e in alcuni casi, i ruoli funzionali di geni specifici sono stati testati 7,8. Un certo numero di regioni genomiche sottostanti cambiamenti morfologici sono stati identificati con promettenti geni candidati, ma questi candidati non sono ancora stati testati funzionalmente 9 – 12. Inoltre, spinarelli sono modelli comuni per gli studi di genetica delle popolazioni / genomica 13,14, speciazione 15, il comportamento 1, endocrinologia 16, ecotossicologia 17, l'immunologia 18 e parassitologia 19. Futuri studi in ciascuno di questi settori beneficeranno della possibilità di eseguire manipolazioni genetiche funzionali in spinarelli. Oltre a manipolare le sequenze codificanti, i ruoli dei geni candidati possono essere valutate studiando le loro sequenze -regulatory cis e funzionalmente crescente, decrescente o eliminando espressione del gene candidato. Microiniezione e transgenesi metodi in spinarelli sono ben stabiliti 7,8,20 e sono stati inizialmente sviluppati utilizzando un meganuclease-mediataMetodo 21 descritto per primo nel Medaka 22. Il metodo microiniezione modificato presentato qui è stato ottimizzato sia per la transgenesi Tol2-mediata e recentemente sviluppato reagenti di modifica del genoma tra Talens e CRISPRs.
Modifiche a cis -regulatory elementi sono pensati per essere critico per l'evoluzione morfologica, come cis -regulatory cambiamenti possono evitare le conseguenze negative pleiotropici di codifica mutazioni 23. Pertanto, prova e il confronto putative sequenze -regulatory cis è diventato un obiettivo centrale di un numero crescente di studi evolutivi. Inoltre, la maggior parte delle varianti di malattie umane sono varianti normative 24,25 e sistemi modello vertebrati sono dolorosamente necessari per studiare cis Funzione di un elemento -regulatory e la logica. I pesci che fertilizzare i loro embrioni esternamente in gran numero offrono potenti sistemi di vertebrati a studiare -Regolamento cis. Il sistema di trasposoni Tol2, in cui commDNA gn per essere integrato nel genoma è fiancheggiato da Tol2 trasposasi siti di legame e di co-iniettato con Tol2 trasposasi mRNA, funziona con alta efficienza per l'integrazione con successo plasmide costruisce sui genomi di pesce 26 – 28. In genere, un potenziale Enhancer è clonato a monte di un promotore basale (come hsp70l 29) e del gene reporter fluorescente come EGFP (enhanced green fluorescent protein) o mCherry in una spina dorsale Tol2 e iniettato con trasposasi mRNA 26. L'osservazione di espressione del reporter fluorescente, sia in embrioni o discendenti con transgeni stabilmente integrati iniettati, fornisce informazioni sulla regolazione spazio-temporale dell'espressione genica guidato dal enhancer putativo. In ulteriori esperimenti, esaltatori validati possono essere utilizzati per guidare sovraespressione tessuto-specifica dei geni di interesse.
Per l'analisi delle più grandi regioni -regulatory cis, di alta qualità genom grande insertolibrerie IC utilizzando cromosomi batterici artificiali (BAC) sono stati costruiti per entrambe le marine e di acqua dolce spinarelli 30. Questi BAC possono essere recombineered per sostituire un gene con un gene reporter fluorescente nel contesto di un grande (150-200 kb) regione genomica 31. Il reporter fluorescente viene poi espressa in un modello spazio-temporale, come determinato dal sequenze regolatrici all'interno del BAC. Per gli studi nei pesci, siti Tol2 possono essere aggiunti alla BAC per facilitare genomico integrazione 32,33. Nelle fasi successive di sviluppo, quando l'ibridazione in situ è tecnicamente impegnativo, la lettura fluorescenza del BAC può essere utilizzato per studiare gli schemi di espressione genica, come è stato dimostrato per stickleback proteina morfogenetica 6 (BMP6) 20. Inoltre, i modelli di espressione fluorescenti in un individuo possono essere monitorati nel corso del tempo, che non può essere realizzato con l'ibridazione in situ. BAC può essere utilizzato anche per aggiungere un additional copia di una regione genomica di aumentare il dosaggio di un gene di interesse.
Per lo studio della funzione del gene, editing genoma è un campo esplosivo espansione che può essere utilizzato per produrre cambiamenti mirati a sequenze genomiche in un'ampia varietà di organismi 34. Trascrizione attivatore-come nucleasi effettrici (Talens) sono, nucleasi modulari sequenza-specifiche originariamente isolato da agenti patogeni delle piante che possono essere progettati proprio per legarsi direttamente ad una sequenza genomica di scelta e di generare un doppio filamento pausa 35,36. Cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / sistemi CAS sono stati originariamente trovati nei batteri e utilizzare un RNA guida e la proteina Cas9 per generare una pausa in una sequenza di DNA bersaglio complementare alla guida 37. La successiva riparazione della rottura a doppio filamento creato da entrambe le Talens e CRISPRs spesso lascia dietro di sé una piccola inserimento o la cancellazione, che possono interferire con la funzione della sequenza bersaglio35-37. In spinarelli, Talens sono stati utilizzati per distruggere l'espressione genica di mira un potenziatore 20, ed entrambi Talens e CRISPRs hanno prodotto con successo le mutazioni in sequenze codificanti (dati non pubblicati). Un protocollo dettagliato per la generazione di CRISPRs per l'utilizzo in zebrafish può essere utilizzato come linea guida per sviluppare CRISPRs per spinarelli 38.
esperimenti di modifica transgenici e genoma richiedono l'introduzione di acidi nucleici in un appena fecondato embrione unicellulare. Con l'introduzione del transgene strumento o del genoma di modifica nelle prime fasi di sviluppo, il numero di cellule figlie geneticamente manipolate in l'embrione è massimizzata. embrioni iniettati vengono poi proiettati visivamente per fluorescenza o molecolarmente sottoposti a screening per le modifiche del genoma. Se le cellule che contribuiscono alla linea germinale sono mirati con successo, il transgene o mutazioni possono essere trasmessi a un sottoinsieme di prole, anche quando post-iniezione letale è elevata. Il pesce a mosaico possono essere outcrossed oincrocia e la loro prole proiettato per recuperare i alleli mutanti o un transgene stabilmente integrata di interesse. Questo protocollo descrive i metodi per l'introduzione di transgeni e l'editing di reagenti genoma in embrioni spinarello uno-cellula e di monitoraggio per le modifiche genomiche di successo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iniettano embrioni stickleback una cella per transgenesi o la modifica del genoma presenta tre sfide principali. In primo luogo, relativamente agli embrioni di zebrafish, lo spinarello embrionali corion è dura e spesso rompere gli aghi. Questo problema può essere superato parzialmente usando micropipette di vetro più spesse e più forti e iniettando perpendicolare al corion (vedi protocollo, figura 2). Assicurare che il meno acqua possibile si aggiunge agli embrioni (quanto basta per causare il corio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH R01 # DE021475 (CTM), un NIH predoctoral formazione di Grant 5T32GM007127 (PAE), e un Graduate Research Fellowship NSF (NAE). Ringraziamo Kevin Schwalbach per l'esecuzione di BAC recombineering e iniezioni, Nick Donde per la generazione di dati di sequenziamento Sanger CRISPR, e Katherine Lipari per il feedback utile sul protocollo di iniezione.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
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