La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos
Summary
Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.
Abstract
El pez espinoso de tres espinas se ha convertido en un potente sistema para estudiar la base genética de una amplia variedad de características morfológicas, fisiológicas y fenotipos de comportamiento. Las notablemente diversos fenotipos que han evolucionado a medida que las poblaciones marinas se adaptan a un sinnúmero de ambientes de agua dulce, junto con la capacidad de cruzar formas marinas y de agua dulce, proporcionan un sistema de vertebrados rara en la que la genética puede ser utilizado para mapear las regiones genómicas que controlan rasgos evolucionado. Excelentes recursos genómicos ya están disponibles, lo que facilita la disección genética molecular de los cambios evolucionados. Mientras que los experimentos de mapeo generar listas de genes candidatos interesantes, se requieren manipulaciones genéticas funcionales para poner a prueba las funciones de estos genes. La regulación génica puede ser estudiado con plásmidos informadores transgénicos y BACs integrados en el genoma utilizando el sistema de transposasa Tol2. Funciones de los genes candidatos específicos y cis-elementos reguladores pueden evaluarse mediante la inducción específicamutaciones con TALEN y CRISPR / Cas9 reactivos edición genoma. Todos los métodos requieren la introducción de ácidos nucleicos en fertilizados embriones stickleback una sola célula, una tarea que se hizo difícil por el espesor corion de embriones de espinosos y la relativamente pequeña y delgada de blastómeros. Aquí, un protocolo detallado para la microinyección de los ácidos nucleicos en embriones de espinosos se describe para aplicaciones transgénicas y edición de genoma para estudiar la expresión génica y la función, así como técnicas para evaluar el éxito de la transgénesis y recuperar líneas estables.
Introduction
Un componente fundamental de la comprensión de cómo surge la biodiversidad es la determinación de las bases genéticas y de desarrollo de los cambios fenotípicos evolucionado en la naturaleza. El pez espinoso de tres espinas, Gasterosteus aculeatus, se ha revelado como un excelente modelo para estudiar la base genética de la evolución. Espinosos han sufrido muchos cambios evolutivos de adaptación como los peces marinos han colonizado un sinnúmero de ambientes de agua dulce en todo el hemisferio norte, lo que resulta en morfológica dramática, fisiológicos y cambios de conducta 1. Los genomas de individuos de veintiún poblaciones de espinosos se han secuenciado y ensamblado, y un mapa de ligamiento de alta densidad se ha generado para mejorar aún más el conjunto de 2,3. Experimentos de mapeo genéticos han identificado regiones genómicas subyacente fenotipos evolucionado 4-6, y en unos pocos casos, el papel funcional de genes candidatos específicos se han probado 7,8. Un número de regiones genómicas que generan cambios morfológicos se han identificado con prometedores genes candidatos, pero estos candidatos no han sido aún probado funcionalmente 9 – 12 El. Además, los espinosos son modelos comunes para estudios de genética de poblaciones / genómica 13,14, 15 especiación, comportamiento, endocrinología 1 16 17, ecotoxicología, la inmunología y parasitología 18 19. Los estudios futuros en cada uno de estos campos se beneficiarán de la capacidad de realizar manipulaciones genéticas funcionales en los espinosos. Además de la manipulación de sus secuencias de codificación, las funciones de los genes candidatos pueden evaluarse mediante el estudio de sus secuencias cis-regulador y aumentando funcionalmente, disminuyendo o eliminando la expresión del gen candidato. Métodos de microinyección y la transgénesis en los espinosos están bien establecidos 7,8,20 y fueron inicialmente desarrollados usando una meganucleasa mediada21 método descrito por primera vez en 22 medaka. El método de microinyección modificado que aquí se presenta ha sido optimizada tanto para la transgénesis mediada por Tol2 y recientemente desarrollado reactivos de edición del genoma incluyendo Talens y CRISPRs.
Se cree que los cambios en los elementos cis-regulador a ser crítica para la evolución morfológica, como cis-regulador cambios pueden evitar las consecuencias negativas de las mutaciones pleiotrópicos 23 de codificación. Por lo tanto, las pruebas y la comparación de secuencias cis-regulador putativo se ha convertido en un objetivo central de un número creciente de estudios evolutivos. Además, la mayoría de las variantes de la enfermedad humanos son variantes de regulación 24,25 y sistemas modelo de vertebrados son muy necesarios para estudiar cis-regulador Función del elemento y la lógica. Los peces que fertilizar sus embriones externamente en un gran número de vertebrados ofrecen sistemas potentes para estudiar -Reglamento cis. El sistema de transposón Tol2, en el que foreign ADN de integrarse en el genoma está flanqueado por Tol2 transposasa sitios de unión y co-inyectados con ARNm transposasa Tol2, funciona con alta eficiencia para la integración con éxito plásmido construye en los genomas de peces 26 – 28. Típicamente, un promotor de potencial se clona aguas arriba de un promotor basal (como hsp70l 29) y el gen reportero fluorescente tal como EGFP (proteína fluorescente verde potenciada) o mCherry en una cadena principal de Tol2 y se inyecta con transposasa mRNA 26. La observación de la expresión del indicador fluorescente, ya sea en embriones o descendientes con transgenes integrados de forma estable inyectados, proporciona información acerca de la regulación espacial y temporal de la expresión génica impulsado por el potenciador putativo. En experimentos adicionales, potenciadores validados se pueden utilizar para conducir la sobreexpresión específica de tejido de genes de interés.
Para el análisis de las regiones cis-regulador más grandes, de alta calidad genoma a gran insertobibliotecas IC mediante cromosomas artificiales bacterianos (BAC) se han construido tanto para los peces espinosos marinos y de agua dulce 30. Estos BAC se pueden recombineered para reemplazar un gen con un gen indicador fluorescente en el contexto de un grande (150 a 200 kb) región genómica 31. El indicador fluorescente se expresa entonces en un patrón espacio-temporal según lo determinado por las secuencias reguladoras dentro de la CAV. Para los estudios en los peces, los sitios Tol2 se pueden añadir a la BAC para facilitar la integración genómica 32,33. En etapas posteriores del desarrollo cuando la hibridación in situ es técnicamente difícil, la lectura fluorescente de la BAC se puede utilizar para estudiar los patrones de expresión de genes, como se ha demostrado para la proteína morfogenética ósea 6 stickleback (BMP6) 20. Además, los patrones de expresión fluorescentes en un individuo pueden ser rastreados a través del tiempo, que no se puede lograr con la hibridación in situ. BAC también se puede utilizar para añadir un additional copia de una región genómica para aumentar la dosis de un gen de interés.
Para el estudio de la función génica, edición genoma es un campo en expansión explosiva que se puede utilizar para producir cambios dirigidos a secuencias genómicas en una amplia variedad de organismos 34. Transcripción nucleasas efectoras del tipo activador de (Talens) son nucleasas modulares, específicos de secuencia originalmente aisladas a partir de patógenos de plantas que pueden ser diseñados precisamente para unirse directamente a una secuencia genómica de elección y generar una doble hebra romper 35,36. Agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / sistemas CAS fueron encontrados originalmente en bacterias y usan una guía de ARN y la proteína Cas9 para generar una ruptura en una secuencia de ADN diana complementaria a la guía 37. La posterior reparación de la rotura de doble cadena creada por ambos Talens y CRISPRs menudo deja tras de sí una pequeña inserción o deleción, lo que puede alterar la función de la secuencia diana35-37. En los espinosos, Talens se han utilizado para alterar la expresión de genes por la orientación un promotor de 20, y ambos Talens y CRISPRs han producido con éxito mutaciones en las secuencias (datos no publicados) de codificación. Un protocolo detallado para la generación de CRISPRs para uso en el pez cebra se puede utilizar como una guía para desarrollar CRISPRs para los espinosos 38.
Transgénicos y genoma experimentos de edición requieren introducción de ácidos nucleicos en un embrión de una célula recién fertilizado. Mediante la introducción de la herramienta de transgén o de edición de genoma temprano en el desarrollo, se maximiza el número de células hijas genéticamente manipulados en el embrión. embriones inyectados se criban entonces visualmente para fluorescencia o molecularmente examinados para modificaciones del genoma. Si las células que contribuyen a la línea germinal están dirigidos con éxito, el transgén o mutación se pueden transmitir a un subconjunto de la descendencia, incluso cuando la letalidad post-inyección es alta. Los peces pueden ser de mosaico o outcrossedentrecruzan y su descendencia tamiza para recuperar los alelos mutantes o un transgén integrado de forma estable de interés. Este protocolo describe métodos para introducir los transgenes y reactivos de edición del genoma en embriones de espinosos de una sola célula y el seguimiento de las modificaciones que darán éxito.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inyección de embriones de espinosos de una sola célula para la transgénesis o la edición genoma presenta tres retos principales. En primer lugar, en relación con embriones de pez cebra, el pez espinoso embrionaria corion es difícil y, a menudo romper las agujas. Este problema puede superarse parcialmente mediante el uso de micropipetas de vidrio más gruesas y más fuertes y la inyección perpendicular al corion (véase el Protocolo, la Figura 2). Asegurar que tan poco agua como sea posible se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por el NIH R01 # DE021475 (CTM), una subvención del NIH predoctoral de Formación 5T32GM007127 (PAE), y una beca de investigación de Graduados de la NSF (NAE). Damos las gracias a Kevin Schwalbach para realizar recombinería y las inyecciones de BAC, Nick Donde para la generación de datos de secuenciación de Sanger CRISPR, y Katherine Lipari de información útil sobre el protocolo de inyección.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
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