Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입
Summary
트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 – 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.
Abstract
큰가시 고기 생선은 형태 학적, 생리의 다양한 유전 적 기초를 공부하는 강력한 시스템, 행동 표현형로 떠오르고있다. 해양 및 민물 형태를 교차 할 수있는 능력과 결합 해양 인구 수많은 담수 환경에 적응로 진화 현저 다양한 표현형은 유전자가 형질 발전 제어하는 게놈 영역을 매핑하는데 사용될 수있는 드문 척추 시스템을 제공한다. 우수 게놈 자원 진화 변화의 분자 유전 학적 해부을 용이하게 사용할 수 있습니다. 맵핑 실험 흥미 후보 유전자의리스트를 생성하지만, 기능적 유전자 조작은 유전자의 역할을 테스트하도록 요구된다. 유전자 조절은 TOL2 트랜스의 시스템을 이용하여 게놈에 통합 된 트랜스 제닉 리포터 플라스미드와 함께 BAC에 조사 할 수있다. 특정 후보 유전자 및 시스 – 규정 요소의 기능은 타겟 유도함으로써 평가할 수있다TALEN 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집 시약 돌연변이. 모든 방법은 수정 된 하나의 셀 큰가시 고기의 배아로 핵산을 도입 필요, 작업이 큰가시 고기 배아의 두께 융모막과 상대적으로 작고 얇은 할구로 도전했다. 여기서, 큰가 배아 내로 핵산 마이크로 인젝션에 대한 상세한 프로토콜은 트랜스 제닉 게놈 편집 유전자의 발현 및 기능을 연구하는 응용뿐 아니라 형질 전환의 성공 여부를 평가하고 안정한 선을 복구하는 방법에 대해 설명한다.
Introduction
생물 다양성은 자연에서 진화 된 표현형 변화의 유전 개발 기지를 결정하는 발생 방법을 이해하는 하나의 기본 구성 요소입니다. 큰가시 고기 생선, Gasterosteus aculeatus는 진화의 유전 적 기초를 공부하는 우수한 모델로 떠오르고있다. 큰가시 고기과 해양 물고기가 북반구의 주위에 수많은 민물 환경을 식민지 것처럼 극적인 형태 학적, 생리 학적 결과, 많은 적응 진화 적 변화를 겪고, 그리고 한 행동 변화 1. 스물 한 큰가 집단에서 개인의 게놈 서열 조립 및 고밀도 링크 맵은 상기 조립체 2,3-을 개선하기 위해 생성되어왔다. 유전자 맵핑 실험은 진화 표현형 4 기본 게놈 영역을 식별 한 6 -, 몇 가지 경우에, 특정 후보 유전자의 기능적 역할 7,8 테스트 한. 형태 학적 변화를 기본 게놈 영역의 숫자는 유망한 후보 유전자로 확인되었다, 그러나이 후보는 아직 기능적으로 9 테스트되지 않은 – 12. 또한, 큰가시 고기과 인구 유전학 / 유전체학 (13, 14), 분화 (15), 행동 (1), 내분비학 (16), 생태 독성학 (17), 면역학 (18)와 기생충학 (19)의 연구를위한 일반적인 모델입니다. 각 필드에서의 앞으로의 연구는 큰가시 고기과의 기능 유전자 조작을 수행하는 능력에서 이익을한다. 이들 코딩 서열의 조작에 더하여, 후보 유전자의 역할은 시스 – 규정 시퀀스를 연구함으로써 기능적 증가 감소 또는 후보 유전자의 발현을 제거함으로써 평가 될 수있다. 큰가시 고기과에 미세 주입 및 형질 전환 방법은 잘 7,8,20를 설립하고 처음 사용하여 개발 하였다 meganuclease 매개방법 (21)는 첫 번째 송사리 (22)에 설명. 여기에 제시된 개질 미세 주입 방법은 모두 TOL2 매개 된 형질 전환에 최적화 최근 TALENs 및 CRISPRs 포함한 게놈 편집 시약을 개발되었다.
시스 규정하는 요소에 대한 변경 사항은 시스 규정하는 변화는 돌연변이 (23)를 코딩의 부정적인다면 발현 결과를 피할 수로, 형태 학적 진화에 중요한 것으로 생각된다. 따라서, 추정 시스 규정하는 순서를 테스트하고 비교하는 진화 연구의 증가의 중심 목표되고있다. 또한, 대부분의 인간 질병 변형 심하게 시스 규정하는 기능 소자 및 로직을 연구하는데 필요한 규제 변이체 24, 25 및 모델 척추 시스템이다. 많은 수의 외부에 자신의 배아를 비옥 물고기 시스 -regulation을 연구하는 강력한 척추 시스템을 제공합니다. 외국 ì되는 TOL2 트랜스포존 시스템게놈에 통합 할 GN DNA가 TOL2의 트랜스가 사이트와 바인딩에 의해 형벌되고, TOL2의 트랜스 mRNA의와 공동 주입 성공적으로 플라스미드 물고기 유전체 (26)에 구축 통합하는 높은 효율로 작동 – 28. 일반적으로 잠재적 인 증강은 TOL2 백본에서 (예 : hsp70l 29)를 기초 프로모터 및 형광 리포터 유전자 등 EGFP로 (강화 된 녹색 형광 단백질) 또는 mCherry의 상류 복제 및 트랜스의 mRNA (26) 주입된다. 형광 기자의 어느 주입 배아 또는 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 가진 자손의 표현의 관측은 추정 증강에 의해 구동 유전자 발현의 시공간 규제에 대한 정보를 제공합니다. 상기 실험에서 검증 증강은 관심 유전자의 조직 – 특이 과발현을 유도하는데 사용될 수있다.
큰 시스 규정하는 지역의 분석, 고품질의 대형 삽입 genom에 대한세균 인공 염색체 (BAC에)를 사용하여 IC 라이브러리는 모두 해양 및 담수 큰가시 고기과 (30)로 구성되어있다. 이들의 BAC는 큰 (1백50-2백킬로바이트)의 맥락에서 형광 리포터 유전자의 게놈 영역 (31)을 가진 유전자를 대체 recombineered 수있다. 는 BAC 내의 조절 서열에 의해 결정되는 형광 리포터이어서 시공간 패턴으로 표현된다. 물고기 연구 내용 TOL2 사이트 게놈 통합 (32,33)를 용이하게하기 BAC에 첨가 될 수있다. 개발의 후기 단계 계내 혼성화에 기술적 도전에서 BAC 형광 판독 큰가 뼈 형태 형성 단백질 6 (Bmp6) (20)에 대해 도시 된 바와 같이, 유전자 발현의 패턴을 연구하는데 사용될 수있다. 또한, 각각의 형광 발현 패턴 계내 혼성화에 달성 될 수없는 시간에 걸쳐 추적 될 수있다. BAC에 또한 additiona을 추가하는데 사용될 수있다게놈 영역의 L 사본은 관심의 유전자의 복용량을 증가시킵니다.
유전자 기능 연구를 위해, 게놈 편집 유기체 (34)의 다양한 게놈 서열을 타겟팅하는 변화를 생성하는 데 사용될 수 폭발적으로 확장 필드이다. 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)는 원래 정확하게 선택의 게놈 시퀀스에 직접 결합하여 이중 가닥이 35, 36을 깰 생성하도록 설계 될 수있다 식물 병원균으로부터 분리 모듈, 순서 특정 뉴 클레아 있습니다. 클러스터 정기적 interspaced 짧은 상동 반복 (CRISPR)은 / CAS 시스템은 원래 세균에서 찾을 수 있으며, 상기 가이드 (37)에 상보적인 표적 DNA 서열의 틈을 발생하도록하는 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 사용 하였다. 종종 TALENs 및 CRISPRs 모두에 의해 생성 된 이중 가닥 나누기 후속 보수는 표적 서열의 기능을 방해 할 수있는 작은 삽입 또는 결실을 남겨35-37. 큰가시 고기과에서 TALENs는 인핸서 (20)를 대상으로 유전자 발현을 방해하는 데 사용되었으며, TALENs 및 CRISPRs 모두 성공적 서열 (미공개 데이터)를 코딩 돌연변이를 생산 하였다. 제브라에 사용 CRISPRs의 생성에 대한 상세한 프로토콜은 큰가시 고기과 38 CRISPRs을 개발하는 지침으로 이용 될 수있다.
형질 전환 및 게놈 편집 실험 새로 수정 된 하나의 배아 세포 내로의 핵산의 도입을 필요로한다. 초기 발달에서 유전자 또는 게놈 편집 툴을 도입함으로써, 배아 유 전적으로 조작 딸 세포의 수를 최대화한다. 주입 된 배아는 시각적으로 형광에 대한 검사 또는 분자 게놈 수정에 대한 상영된다. 항체 2.12.1fx에 기여하는 세포를 타겟으로하는 경우, 형질 전환 또는 돌연변이 포스트 분사 치사율이 높은 경우에도, 자식들의 서브 세트로 전달 될 수있다. 모자이크 물고기 outcrossed 할 수 있습니다 또는교차하고 그들의 자손은 돌연변이 대립 유전자 또는 관심의 안정적 통합 된 형질 전환 유전자를 복구하는 상영. 이 프로토콜은 하나의 셀 큰가시 고기의 배아에 유전자와 게놈 편집 시약을 도입하고 성공적으로 게놈 수정에 대한 모니터링하기위한 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
형질 전환 또는 게놈 편집 주입 한 세포 큰가시 고기의 배아는 세 가지 주요 과제를 제시한다. 첫째, 제브라 피쉬 배아를 기준으로는 큰가시 고기 배아 융모막은 힘든 종종 바늘을 깰 것입니다. 이 문제는 부분적으로 두껍고 강한 유리 마이크로 피펫을 사용하여 융모막에 수직 주입함으로써 극복 될 수있다 (프로토콜,도 2 참조). 가능한 것과 약간의 물을 확보하는 것은 배아에 추가됩?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH Predoctoral 교육 그랜트 5T32GM007127 (PAE) 및 NSF 대학원 연구 활동 (NAE)에 의해 부분적으로 투자되었다. 우리는 주입 프로토콜에 대한 유용한 피드백을 CRISPR 생거 시퀀싱 데이터를 생성 BAC의 recombineering 및 주사, 닉 Donde을 수행하는 케빈 Schwalbach에 감사하고, 캐서린 리 파리.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
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