Summary

Kinetic Mesure et visualisation en temps réel de Reprogrammation somatique

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

Le protocole présenté dans cette étude décrit des procédés pour la surveillance en temps réel de la progression de la reprogrammation par l'intermédiaire de la mesure cinétique des marqueurs de cellules souches pluripotentes positives et négatives à l'aide de l'analyse de cytométrie en flux. Le protocole comprend également l'évaluation fondée sur l'imagerie-de la morphologie, et le marqueur ou l'expression rapporteur lors de la génération iPSC.

Abstract

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.

This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

Introduction

les cellules de patients dérivées induites souches pluripotentes (CISP) sont des outils prometteurs pour la thérapie cellulaire et le criblage de médicaments. Elles fournissent une source autologue de cellules pour la thérapie. En outre, ils englobent un très large éventail de fonds génétiques, ce qui permet une analyse détaillée in vitro de maladies génétiques au – delà des lignes de courant les cellules souches embryonnaires (ESC) permettrait. Des progrès récents ont conduit au développement de plusieurs procédés pour produire iPSCs, y compris une reprogrammation avec le virus Sendai, des plasmides épisomiques ou ARNm 1,2. Notamment, les différentes méthodes de reprogrammation sont associés à des niveaux d'efficacité et de sécurité différents, et sont susceptibles de différer d'autres façons qui influent sur leur pertinence pour diverses applications. Avec la disponibilité d'une variété de technologies de reprogrammation, il est devenu important de développer des méthodes pour évaluer le processus de reprogrammation. La plupart des méthodes existantes reposent sur l'inspection qualitative de la morphologie ou la colorationavec des colorants et des anticorps spécifiques de cellules souches. Une méthode développée récemment fait appel à des journalistes de fluorescence lentiviraux qui sont sensibles aux miARN spécifiques à la CFP ou des ARNm spécifiques de cellules différenciées 3. Ces méthodes de surveillance facilitent la sélection et l'optimisation des techniques de reprogrammation pour des situations différentes. Par exemple, CDy1 a été utilisé comme une sonde fluorescente pour le début de CSPi afin de dépister des modulateurs de reprogrammation 4. La capacité d'observer et de comparer les différentes expériences de reprogrammation est également critique pour une meilleure compréhension du processus lui-même. Par exemple, on sait maintenant que certains types de cellules somatiques sont plus faciles à reprogrammer 5 que d' autres, et que les cellules passent par des états intermédiaires pendant la reprogrammation 6-8. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents du processus de reprogrammation ne sont pas encore complètement compris et, par conséquent, les différences exactes entre les méthodes de reprogrammation restent également à defined. Ainsi, les méthodes de suivi, d'évaluation et de comparaison des événements de reprogrammation continuent d'être critique pour le domaine des cellules souches.

Les méthodes décrites dans ce protocole permettent le suivi et l'évaluation du processus de reprogrammation et illustrent la façon dont ces techniques peuvent être utilisées pour comparer les différents ensembles de réactifs de reprogrammation. La première approche consiste à cytométrie en flux analyse en utilisant des combinaisons d'anticorps dirigés contre la cellule positive et négative souches pluripotentes (PSC) des marqueurs. Le second couple d'approche imagerie en temps réel et la mesure de la confluence totale (la surface couverte pour cent par les cellules) et la confluence des signaux de marqueur (la surface couverte pour cent par les signaux fluorescents).

Protocol

1.Solution et moyennes Préparation Sous – sol Membrane Matrix (Purifié de Engelbreth-Holm-Swarm tumeur) décongeler lentement la matrice de membrane basale (5 ml) sur de la glace à 4 ° C pendant une nuit. Diluer la solution stock 1: 1 avec 5 ml de glace froide, DMEM stérile / F-12 dans un pré-refroidi 15 ml tube stérile, conique. Distribuer aliquotes dans des tubes micro de centrifugeuse de 1,5 ml stériles pré-réfrigérés et stocker immédiatemen…

Representative Results

Surveillance Kinetics Reprogrammation par cytométrie en flux CD44 est un marqueur de fibroblaste alors SSEA4 est un marqueur PSC 6,10. Comme prévu à partir de ce modèle d'expression, par cytométrie de flux de fibroblastes BJ montre un SSEA4 – CD44 + population qui facilite la création de portes quadrants en combinaison avec l'échantillon souillures. Au cours de …

Discussion

This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Tchad MacArthur pour des discussions utiles.

Materials

DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1X) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

References

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Cite This Article
Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

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