Summary

Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

Das Protokoll in dieser Studie präsentierten beschreibt Verfahren zur Echtzeit-Überwachung der Reprogrammierung Progression über die kinetische Messung von positiven und negativen pluripotenten Stammzellmarker Durchflusszytometrie-Analyse. Das Protokoll enthält auch die Imaging-basierte Beurteilung der Morphologie und Marker oder Reporter-Expression während der iPS-Generation.

Abstract

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.

This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

Introduction

Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte Invitro – Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai – Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs 1,2. Bemerkenswerterweise sind verschiedene Verfahren der Reprogrammierung zugeordnet Ebenen der Effizienz und Sicherheit Variation und sind wahrscheinlich auf andere Weise zu unterscheiden, die ihre Eignung für verschiedene Anwendungen beeinflussen. Mit der Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Umprogrammierung Technologien hat es wichtig geworden, Methoden zu entwickeln, um die Reprogrammierung zu bewerten. Die meisten existierenden Verfahren stützen sich auf die qualitative Kontrolle der Morphologie oder Färbungmit Stammzell-spezifische Farbstoffe und Antikörper. Eine kürzlich entwickelte Methode nutzt lentiviralen Fluoreszenz – Reporter , die empfindlich auf PSC-spezifischen miRNAs oder differenzierte zellspezifischen mRNAs 3. Eine solche Überwachungsmethoden, die Auswahl und Optimierung der Reprogrammierung Techniken für unterschiedliche Situationen erleichtern. Zum Beispiel wurde als fluoreszierende Sonde für frühe iPSCs um zu screenen für Umprogrammierung Modulatoren 4 CDY1 verwendet. Die Fähigkeit, zu beobachten und verschiedene Umprogrammierung Experimente vergleichen ist auch entscheidend für sich ein besseres Verständnis des Verfahrens zu gewinnen. Zum Beispiel ist es nun bekannt , dass einige somatische Zelltypen leichter sind als andere umprogrammieren 5, und dass die Zellen gehen durch Zwischenzustände während 6-8 Neuprogrammierung. Leider sind die Mechanismen, die die Reprogrammierung Verfahren zugrundeliegenden noch nicht vollständig verstanden und folglich bleiben die genauen Unterschiede zwischen Umprogrammierung Methoden auch als defined. So Methoden zur Überwachung, Bewertung und Neuprogrammierung Ereignisse Vergleich weiterhin für die Stammzell-Feld kritisch zu sein.

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglichen die Überwachung und Beurteilung der Umprogrammierung und zeigen, wie diese Techniken verwendet werden können, verschiedene Sätze von Umprogrammierung Reagenzien zu vergleichen. Der erste Ansatz beinhaltet Durchflusszytometrie analysiert Kombinationen von Antikörpern gegen positive und negative pluripotenten Stammzellen (PSC) Marker. Der zweite Ansatz Paare Echtzeit-Bildgebung und die Messung der Gesamt Einmündung (die Fläche Prozent Oberfläche durch die Zellen bedeckt) und Einmündung der Markierungssignale (Bereich Prozent Oberfläche durch die fluoreszierenden Signale abgedeckt).

Protocol

1.Solution und Medium Vorbereitung Basalmembranmatrix (Gereinigt aus Engelbreth-Holm-Swarm – Tumor) tauen langsam Basalmembranmatrix (5 ml) auf Eis bei 4 ° C über Nacht. Von der Stammlösung 1: 1 mit 5 ml eiskaltem, sterilem DMEM / F-12-Medium in einem sterilen, vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen. Dispense Aliquots in vorgekühlte 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei -20 ° C. Vor Gebrauch, tauen die gefrorenen 1: 1 Basalm…

Representative Results

Überwachung Reprogrammierung Kinetics Mit Flow Cytometry CD44 ist ein Fibroblasten – Marker während SSEA4 ein PSC Marker 6,10 ist. Wie aus diesem Expressionsmuster erwartet, Durchflusszytometrie von BJ Fibroblasten zeigt eine SSEA4 – CD44 + Population, die die Schaffung von Quadranten Toren in Kombination mit der ungefärbten Probe erleichtert. Während Reprogrammierung von DF1 Fibro…

Discussion

This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Chad MacArthur für hilfreiche Diskussionen.

Materials

DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1X) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H., Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

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Cite This Article
Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

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