Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
Secundaire groei stam in de bomen en de bijbehorende houtvorming zijn aanzienlijk, zowel uit biologische en commerciële perspectieven. Echter, relatief weinig bekend is over de moleculaire controle die hun ontwikkeling regeert. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de fysieke, middelen en tijd beperkingen vaak geassocieerd met de studie van de secundaire groeiprocessen. Een aantal van de in vitro technieken zijn gebruikt waarbij het gaat om planten een deel of de hele plant systeem in zowel houtige en niet-houtige plantensoorten. Echter, vragen over hun toepasbaarheid voor de studie van de secundaire groei stam processen, de weerbarstigheid van bepaalde soorten en arbeidsintensiteit zijn vaak onbetaalbaar voor medium tot high throughput toepassingen. Ook als we kijken naar steel ontwikkeling en houtvorming secundaire de specifieke kenmerken in het kader van het onderzoek mogelijk alleen meetbare worden laat in de levenscyclus van een boom na een aantal jaren van groei. Bij het aanpakken van deze uitdagingen alternatief in vivo protocols zijn ontwikkeld, genaamd-geïnduceerde somatische Sector Analysis, die de oprichting van transgene somatische weefsel sectoren direct te betrekken bij het voortgezet stengel van de plant. Het doel van dit protocol is een efficiënte, eenvoudige en relatief snelle manier om transgene plantenweefsel secundaire voor gentherapie en promotor functionele karakterisatie die kunnen worden gebruikt in verschillende boomsoorten creëren verschaffen. Hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat transgene stam sectoren voortgezet kan worden gemaakt in alle levende weefsels en celtypen secundaire stengels van verschillende boomsoorten en hout morfologische kenmerken, zowel als promotor expressiepatronen in secundaire stengels beheersbaar zijn; vergemakkelijken gemiddeld tot hoog throughput functionele karakterisatie.
Introduction
Boom stengels bevatten een aanzienlijke hoeveelheid van de planeten biomassa en zijn van grote biologische, culturele en commerciële belang. Secundaire stengels maken leefgebied door het verstrekken van middelen en onderdak voor vele andere levensvormen. Ze leveren tal van andere diensten van de ecosystemen waarin ze wonen en werken als een hernieuwbare grondstof voor de productie van hout, pulp en papier en andere hout en niet-houtproducten. Secundaire steel ontwikkeling en meer specifiek houtvorming wordt beheerst door complexe moleculaire systeem dat de ontwikkeling van specifieke celtypen reguleren, de biochemische samenstelling van hun celwanden en hoe zij worden weefsels en organen te vormen. Ontrafeling van de moleculaire basis van secundaire ontwikkeling steel en houtvorming wordt verstoord door vele factoren, waaronder de variabiliteit van hout en steel eigenschappen binnen en tussen de stengels, lange generatie tijden, out-kruising paring systemen, hoge heterozygotie, hoge genetische belasting, seizoensgebonden slaaptoestand, lang volwassentrait vestiging periodes en de enorme fysieke grootte van volwassen bomen. Hierdoor begrip secundaire steel ontwikkeling ten opzichte van de gedetailleerde kennis van de meeste andere aspecten van de moleculaire controle van plantenontwikkeling, nog in de kinderschoenen.
Een aantal in vitro technieken zijn gebruikt voor onderzoek en begrijpen secundaire stam ontwikkeling, met name hout en secundaire vorming celwand. Deze protocollen gepaard met het gebruik van de gehele plant of deel systemen, waarbij ofwel transgene planten worden gemaakt of specifieke secundaire cellen of weefsels worden getransformeerd voor de studie van specifieke aspecten van hout en / of secundaire stuurpen ontwikkeling 1. Transgene planten kunnen worden gewonnen na genetische transformatie van diverse plantaardige weefsels en celtypen, maar het is een langzame, met name bij de analyse houtvezel eigenschappen vanwege de lange regeneratie en steel rijpingstijden (in de orde van jaren), hoge technische en arbeid demands, lage omzet van kandidaatgenen alsook problemen in het propageren van een aantal houtachtige plantensoorten. Soortgelijke technieken zijn ontwikkeld in niet-houtige modelsysteem zoals Arabidopsis die succesvol sommige van deze beperkingen te overwinnen, maar niet alle secundaire stamcellen celtypen een aanwezig in deze stammen en kenmerken in verband met seizoensinvloeden levensduur kan niet worden onderzocht bij deze soorten 2. Als alternatief plantendeel systemen, zoals Pinu s radiata calluscultures 3 vermindering van de bijbehorende termijnen. Deze werkwijzen zijn echter beperkt tot de studie van een celtype en lijden soortgelijke beperkingen als vermeld in vitro experimenten. Ook apicale stam culturen 4 waarbij hele stam explantaten hebben aangetoond belofte, maar nog niet zijn toegepast voor de studie van specifieke genen of promotoren van belang. Meer recent is een alternatief protocol waarbij hairy wortelkweken ontwikkeld voor eucalyptus en is met succes5 toegepast, deze wijze nog nodig vitro kweek, omvat zijwortels plaats stengels en tot op heden is beperkt tot één boomsoorten.
Geïnduceerde somatische sector analyse (ISSA), zoals hier beschreven, is ontwikkeld om een aantal van deze problemen het verstrekken van een medium tot high throughput screening functionele tool voor genen en promoters met een vermoedelijke rol in hout vorming en ontwikkeling secundaire stam weefsel te overwinnen. ISSA is een in vivo transformatie en screening systeem dat is ontwikkeld om de tijd voor transgene cellen en weefsels produceren een intacte secundaire stam het ondervangen arbeid verminderen, technische en doorvoer beperkingen van routinematig gebruikt in vitro werkwijzen. De hier beschreven protocollen zorgen voor het gelijktijdig creëren van honderden onafhankelijk getransformeerd weefsel sectoren en cellen in secundaire stengels binnen een korte tijd, in de boomsoorten weefsel van belang zonder gGenetic en / of milieu variatie binnen relatief korte tijd frames en de lage arbeidskosten. ISSA in vivo technieken werden voor het eerst beschreven voor het voortgezet steel 6 en bud 7 weefsels en hebben sindsdien in het voortgezet stam weefsel werd verfijnd door studies van genen en / of promoters die betrokken zijn bij cambial differentiatie en omvatten: tubuline (TON) 8, fascicline-achtige arabinogalactan ( FLA) 9, cellulose synthase (CESA) 10, secundaire celwand geassocieerd NAC domein (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 en echt interessant nieuw gen (RING) H2 eiwit 13. Deze studies werden uitgevoerd in het voortgezet stengels van populieren en eucalyptus planten en gaf inzicht in de cel morfologie, celwand chemie en genexpressie.
De hier beschreven protocollen zijn bedoeld om de ervaring een samenbrengennd kennis die is opgedaan door de ontwikkeling en toepassing van ISSA uit een reeks van gepubliceerde en ongepubliceerde studies in het afgelopen decennium. Zij richten zich op de in vivo transformatie van secundaire stam weefsels 6 en zich concentreren op studies met Populus alba 'pyramidalis' kloon, Eucalyptus globulus evenals 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonen. Dit document neemt onderzoekers via het protocol van het kweken van planten en bacteriën, de transformatie van stamcellen weefsels, de groei en de oogst van het weefsel, de identificatie van transgene cellen en weefsels, voorbereiding op fenotypische evaluaties en methoden voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Terwijl technieken zijn met succes toegepast op de celwand monosaccharide samenstelling meet ook 9,11, als gevolg van de beperkte ruimte, dit document richt zich op technieken die worden gebruikt voor het meten van cellen en weefsel morfologie en het begrijpen van genexpressie patronen in het voortgezet stalleen ems. Dienovereenkomstig, het protocol zoals geschetst is geschikt voor mensen op zoek naar meer inzicht in de rol en / of expressie van genen in verband met secundaire krijgen stelen met behulp van een low cost, technisch eenvoudig, en medium tot high throughput methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ISSA protocol is een relatief eenvoudige en efficiënte methode voor het creëren van transgene stam weefsels in boomsoorten in de ruimte van een paar maanden voor de analyse van genen en promoters van belang betrokken zijn in hout en steel formatie. Kleine moeite, voorbij het houden van planten in leven, is nodig om transgene stam weefsel na inenting, die staat in tegenstelling tot in vitro methoden, waar uitgebreide kweek is nodig om weefsel of planten, waar de houtproductie kan tot jaar te beginnen of wan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
