Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
Вторичный рост стебля у деревьев и формирование связано древесины являются значительными как от биологических и коммерческих перспектив. Тем не менее, относительно мало известно о молекулярном контроле, который регулирует их развитие. Это отчасти из-за физического ресурса, и ограничений по времени часто было связано с изучением вторичных процессов роста. Ряд методов в пробирке были использованы с участием либо части растений или всей системы растений в обоих древесных и недревесных видов растений. Тем не менее, вопросы об их применимости для изучения процессов вторичного роста стволовых, Упорство некоторых видов и интенсивности труда зачастую непомерно высокой для средних и высоких приложений пропускной способности. Кроме того, при взгляде на развитие стволовых и древесины формирования вторичного специфические черты под следствием может стать только измеримы в конце жизненного цикла дерева после нескольких лет роста. В решении этих проблем альтернативы в естественных условиях рrotocols были разработаны, названный Индуцированные Анализ Соматические сектора, которые предусматривают создание трансгенных секторов соматические ткани непосредственно на вторичном стволе растения. Целью данного протокола является обеспечение эффективной, простой и относительно быстрые средства для создания трансгенного вторичной растительной ткани для гена и промотора функциональной характеристики, которые могут быть использованы в различных пород деревьев. Результаты, представленные здесь, показывают, что трансгенные вторичные стволовые секторы могут быть созданы во всех живых тканях и типах клеток во вторичной стебли различных пород деревьев и что дерево морфологических признаков, а также экспрессии промотора паттернов во вторичных стеблями можно легко оценить облегчение от средней до высокой пропускная способность функциональные характеристики.
Introduction
Дерево стебли содержат значительное количество биомассы планеты и имеют огромное биологическое, культурное и коммерческое значение. Вторичные стебли создают среду обитания путем выделения ресурсов и приют для многих других форм жизни. Они доставляют множество других услуг экосистем, которые они населяют и выступают в качестве возобновляемого ресурса для производства лесной, целлюлозно-бумажной и других древесных и недревесных продуктов. Вторичное развитие стволовых и более конкретно формирование древесины определяется сложной молекулярной системы, которые регулируют развитие специфических типов клеток, биохимический состав их клеточных стенок и как они устроены с образованием тканей и органов. Анатомический молекулярную основу вторичного развития стебля и формирования древесины посрамлен многими факторами, включая изменчивость древесины и стволовых свойств внутри и между стеблями, продолжительным периодом генерации, Ауткроссинг соединяемые системы, высокая гетерозиготность, высокая генетическая нагрузка, сезонное пок, долгое зрелыйTrait периоды создания и чистой физический размер зрелых деревьев. В результате, понимание вторичного развития стволовых относительно детального знания большинства других аспектов молекулярного контроля развития растений, все еще находится в зачаточном состоянии.
Ряд методов в пробирке были использованы для изучения и понимания вторичное развитие стебля, в частности древесины и формирования вторичной клеточной стенки. Эти протоколы предусматривают использование целого растения или части растения систем, где либо трансгенные растения , созданные или специфические вторичные клетки или ткани , которые трансформируются для изучения конкретных аспектов древесины и / или развитие вторичного штока 1. Трансгенные растения могут быть восстановлены пост генетической трансформации из широкого спектра растительных тканей и типов клеток, однако, прогресс идет медленно, в частности, при анализе древесного волокна черты из-за длительного регенерации и времени созревания стволовых (в порядке лет), высокие технические и труда ДеманDS, низкая пропускная способность генов-кандидатов, а также трудности в распространении некоторых видов древесных растений. Аналогичные методы были разработаны в модельной системе недревесной , таких как Arabidopsis, успешно преодолеть некоторые из этих ограничений, но не все вторичные типы стволовых клеток в подарок в эти основы и черты характера , связанные с сезонностью или продолжительности жизни не могут быть изучены в таких видов 2. В качестве альтернативы, часть системы растений, такие как Pinu сек Радиата каллусных 3 уменьшить связанные временные рамки. Эти методы , однако, ограничивается изучением отдельного типа клеток и страдают подобными ограничениями , как отмечено для экспериментов в пробирке. Точно так же, вершинные стволовые культуры 4 с участием целых стволовых эксплантов показали обещание , но пока еще не применялись для изучения специфических генов или стимуляторы , представляющих интерес. Совсем недавно, альтернативный протокол с участием волосатых корневых культур была разработана для эвкалипты и успешно5 применяется, однако, этот метод еще требует культивирования в лабораторных условиях , включает в себя вторичные корни , а не стебли и на сегодняшний день оно ограничивается одним видом деревьев.
Индуцированные анализ соматической сектора (МАСО), как описано здесь, был разработан, чтобы преодолеть некоторые из этих проблем, обеспечивая при средней до высокой пропускной способностью инструмента функционального скрининга для генов и промоторов с подозрением на роли в формировании древесины и развития вторичного стволовых тканей. МАСО в естественных условиях трансформации и скрининга системы , которая была разработана , чтобы сократить время , необходимое для получения трансгенных клеток и тканей в интактном вторичного стебля, преодолевая рабочую силу, технические и ограничения пропускной способности обычно используются в методах лабораторных условиях . Описанные здесь протоколы позволяют для одновременного создания сотен независимо друг от друга трансформированных секторов тканей и клеток в вторичные стебли в течение короткого периода времени, в породам и интересующей ткани без гenetic и / или окружающей среды изменение в относительно короткие сроки и низкая стоимость рабочей силы. ISSA методы в естественных условиях впервые были описаны для вторичного стволовых 6 и бутон 7 тканей и с тех пор был усовершенствован во вторичной стволовых ткани с помощью исследований генов и / или промоторов , участвующих в камбиального дифференциации и включают в себя: тубулина (БТУ) , 8, fasciclin типа арабиногалактан ( FLA) 9, целлюлоза – синтазы (CESA) 10, вторичная клеточная стенка-ассоциированный домен NAC (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 и действительно интересный новый ген (КОЛЬЦО) H2 белка 13. Эти исследования были проведены в средних стеблей тополя и эвкалиптовых растений и поделились соображениями относительно морфологии клеток, химии клеточной стенки и экспрессии генов.
Протоколы, описанные здесь, предназначены, чтобы объединить опыт?го знания, полученные на основе разработки и применения МАСО из ряда опубликованных и неопубликованных исследований за последнее десятилетие. Они сосредоточены на трансформации в естественных условиях вторичных стволовых тканей 6 и сосредоточиться на исследованиях с участием клона тополь белый 'пирамидальный', эвкалипт шаровидный, а также 11 эвкалипт шаровидный х camaldulensis клонов. Этот документ принимает исследователей через протокол от выращивания растений и бактерий, трансформации стволовых тканей, роста и урожая ткани, идентификации трансгенных клеток и тканей, подготовка к фенотипическим оценок и методов для сбора и анализа данных. В то время как методы были успешно применены для измерения моносахаридную состав клеточной стенки также 9,11, из – за пространственных ограничений, этот документ концентрируется на методах , используемых для измерения клетки и морфологию ткани и для понимания паттернов экспрессии генов в средней сттолько СЭМ. В соответствии с этим протоколом, как указано подходит для тех, кто хочет, чтобы получить более полное представление о роли и / или экспрессии генов, связанных с вторичным стеблями с использованием низкой стоимости, технически простой и средней до высокой пропускной способности метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол МАСО является относительно простой и эффективный метод для создания трансгенных стволовых тканей в древесных пород в пространстве нескольких месяцев для анализа генов и промоутеров, представляющих интерес, участвующих в древесине и стволовых образование. Немного усилий, за…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
