L'uso di Induced somatica Settore Analisi (ISSA) per studio dei geni e promotori coinvolti nella formazione del legno e Sviluppo secondaria dello stelo
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
la crescita secondaria dello stelo in alberi e formazione del legno associato sono significativi sia dal punto di vista biologico e commerciali. Tuttavia, relativamente poco si sa circa il controllo molecolare che governa il loro sviluppo. Questo è in parte dovuto alla fisica, risorse e limitazioni di tempo spesso associato con lo studio dei processi di crescita secondari. Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati coinvolge sia parte di pianta o di tutto il sistema impianto sia legnoso e specie vegetali non legnose. Tuttavia, le domande circa la loro applicabilità per lo studio dei processi di crescita secondaria dello stelo, la riluttanza di alcune specie e l'intensità di lavoro sono spesso proibitivi per medie e applicazioni ad alta produttività. Inoltre, se si considerano la formazione di sviluppo gambo e legno secondario i tratti specifici sotto inchiesta potrebbero diventare solo misurabile fine del ciclo di vita di un albero, dopo diversi anni di crescita. In queste sfide alternativa in vivo protocols sono stati sviluppati, chiamato indotta somatica Analisi settoriale, che comporta la creazione di settori dei tessuti somatici transgenici direttamente nella secondaria dello stelo della pianta. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un mezzo efficace, semplice e relativamente veloce generare transgenico tessuti vegetali secondaria per il gene e caratterizzazione funzionale promotore che può essere utilizzato in una varietà di specie di albero. I risultati qui presentati indicano che i settori staminali secondarie transgenici possono essere creati in tutti i tessuti vivi e di tipi di cellule nel secondario steli di una varietà di specie arboree e che il legno caratteristiche morfologiche e pattern di espressione promotore di secondaria steli può essere facilmente valutata facilitare medio-alta caratterizzazione funzionale di throughput.
Introduction
Albero deriva comprendono una notevole quantità di pianeti biomassa e sono di grande importanza biologica, culturale e commerciale. Secondaria steli creare habitat, fornendo risorse e rifugio per molte altre forme di vita. Forniscono molti altri servizi per gli ecosistemi in cui vivono e agiscono come risorsa rinnovabile per la produzione di legname, polpa e carta e altri prodotti di legno e non legnosi. sviluppo gambo secondario e più specificamente formazione del legno è regolata dal sistema molecolare complessa che regolano lo sviluppo di specifici tipi cellulari, la composizione biochimica delle loro pareti cellulari e come sono disposte a formare tessuti e organi. Dissezione delle basi molecolari di sviluppo secondaria dello stelo e la formazione del legno è confuso da molti fattori tra cui la variabilità delle proprietà del legno e staminali all'interno e tra le steli, lunghi tempi di generazione, out-crossing sistemi di accoppiamento, alta eterozigosi, alto carico genetico, dormienza stagionale, lungo maturoperiodi stabilimento tratto e la dimensione fisica pura e semplice di alberi maturi. Come risultato, comprensione dello sviluppo stelo secondaria rispetto alla conoscenza dettagliata della maggior parte degli altri aspetti del controllo molecolare di sviluppo delle piante, è ancora nella sua infanzia.
Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati per studiare e comprendere lo sviluppo secondaria dello stelo, in particolare il legno e la formazione della parete cellulare secondaria. Questi protocolli prevedono l'utilizzo di piante intere o sistemi parte pianta, dove vengono creati sia piante transgeniche o cellule secondaria specifici o tessuti si trasformano per lo studio di aspetti specifici di legno e / o sviluppo secondaria dello stelo 1. Le piante transgeniche possono essere recuperati trasformazione post genetico da una vasta gamma di tessuti vegetali e tipi di cellule, tuttavia, il progresso è lento, soprattutto nell'analisi tratti di fibra di legno a causa di lunga rigenerazione e stelo tempi di maturazione (dell'ordine di anni), alta tecnica e Deman lavorods, bassa produttività dei geni candidati, nonché difficoltà di moltiplicazione alcune specie di piante legnose. Tecniche simili sono state sviluppate nel sistema modello non legnoso, come Arabidopsis che superare con successo alcune di queste limitazioni, ma non tutti i tipi di cellule staminali secondarie un presente in questi steli e le caratteristiche legate alla stagionalità o la longevità non può essere studiato in tali specie 2. In alternativa, i sistemi Parte della pianta, come ad esempio Pinu s radiata callo culture 3 riducono i tempi associati. Questi metodi sono tuttavia limitati allo studio di un tipo di cellula singola e soffrono vincoli simili come osservato per esperimenti in vitro. Allo stesso modo, le culture staminali apicali 4 coinvolgono espianti staminali intere hanno mostrato risultati promettenti, ma ancora non sono state applicate per lo studio di geni o promotori di interesse specifici. Più recentemente, un protocollo alternativo coinvolge colture di radici pelose è stato sviluppato per eucalypts ed è stato correttamenteapplicato 5, tuttavia, questo metodo richiede ancora nella coltivazione in vitro, coinvolge radici secondarie, piuttosto che i gambi e fino ad oggi si è limitato a una singola specie di alberi.
Induced analisi di settore somatica (ISSA), come descritto qui, è stato sviluppato per superare alcuni di questi problemi fornendo un mezzo per un throughput elevato strumento di screening funzionale dei geni e promotori con presunti ruoli in formazione del legno e lo sviluppo del tessuto secondaria dello stelo. ISSA è una trasformazione e di screening sistema in vivo che è stato sviluppato per ridurre il tempo necessario per produrre cellule transgeniche e tessuti in uno stelo secondaria intatta superando lavoro, limitazioni tecniche e throughput abitualmente utilizzati metodi in vitro. I protocolli descritti consentono la creazione simultanea di centinaia di settori tissue trasformati indipendentemente e cellule secondaria steli entro un breve periodo di tempo, nelle specie arboree e tessuto di interesse senza gvariazione Enetic e / o ambientale in tempi relativamente brevi e costo del lavoro basso. ISSA vivo tecniche in sono stati descritti per la secondaria dello stelo 6 e Bud 7 tessuti e da allora sono stati raffinati in tessuto secondaria dello stelo attraverso studi di geni e / o promotori coinvolti nella differenziazione cambiale e comprendono: tubulina (TUB) 8, fasciclin simile Arabinogalactan ( FLA) 9, cellulosa sintasi (CESA) 10, parete cellulare associato dominio nac secondaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e veramente interessante nuovo gene (RING) H2 proteina 13. Questi studi sono stati condotti in secondaria steli di piante di pioppo e eucalipto e forniti approfondimenti morfologia delle cellule, la chimica della parete cellulare e l'espressione genica.
I protocolli descritti qui hanno lo scopo di riunire l'esperienza di unND conoscenze acquisite attraverso lo sviluppo e l'applicazione di ISSA da una serie di studi pubblicati e non pubblicati negli ultimi dieci anni. Essi si concentrano sulla trasformazione in vivo dei tessuti staminali secondarie 6 e si concentrano su studi che coinvolgono clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus così come 11 Eucalyptus globulus x cloni camaldulensis. Questo documento prende ricercatori attraverso il protocollo dalla coltivazione di piante e batteri, la trasformazione dei tessuti staminali, la crescita e la raccolta di tessuto, identificazione di cellule e tessuti transgenici, preparazione per le valutazioni fenotipiche e metodi per la raccolta e l'analisi dei dati. Mentre le tecniche sono state applicate con successo per misurare la composizione monosaccharide parete cellulare anche 9,11, a causa di limitazioni di spazio, questo documento si concentra sulle tecniche utilizzate per la cella di misura e la morfologia dei tessuti e comprensione dei modelli di espressione genica in v secondariaSME soltanto. Di conseguenza, il protocollo come descritto è adatto a coloro che desiderano acquisire ulteriori approfondimenti sul ruolo e / o l'espressione dei geni legati alla secondaria steli con un basso costo, tecnicamente facile e medio-metodo di throughput elevato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo ISSA è un metodo relativamente semplice ed efficiente per la creazione di tessuti staminali transgeniche in specie di alberi nel giro di pochi mesi per l'analisi dei geni e promotori di interesse coinvolti in legno e stelo formazione. Poco sforzo, al di là di mantenere in vita le piante, è necessario far crescere transgenico tessuti staminali dopo l'inoculazione, che è in contrasto con i metodi in vitro in cui è necessario vasta coltura per mantenere il tessuto o le piante, dove la pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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