本文介绍了一种可在相对较短的时间内，对树木次生茎组织中的基因和启动子结构进行中高通量功能表征的实验方案。该方法高效、操作简便，且可广泛适用于多种树木物种。
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本文内容
摘要
摘要
树木的次生茎生长及相关木材形成在生物学和商业上均具有重要意义。然而，关于调控其发育过程的分子机制，目前所知仍相对有限。部分原因在于研究次生生长过程常受到物理条件、资源和时间的限制。已有多种体外（in vitro）技术被应用于木本和非木本植物，涉及植物器官或完整植株系统。然而，这些方法在研究次生茎生长过程中的适用性、某些物种的难转化性以及较高的劳动强度，常常限制了其在中高通量应用中的使用。此外，在研究次生茎发育和木材形成时，所关注的特定性状往往需要经过数年的生长后才能在树木生命周期的后期进行测量。为应对这些挑战，已开发出一种名为诱导体细胞区段分析（Induced Somatic Sector Analysis）的替代体内（in vivo）实验方案，该方法通过在植物次生茎内直接产生转基因体细胞区段来实现研究目的。本实验方案旨在提供一种高效、简便且相对快速的方法，用于在多种树种中创制转基因次生植物组织，以实现基因和启动子功能的表征。本文展示的结果表明，可在多种树种次生茎的所有活体组织和细胞类型中成功产生转基因次生茎区段，并可便捷地评估次生茎中的木材形态性状以及启动子表达模式，从而促进中高通量的功能特性分析。
引言
树木茎干占据了地球生物量的很大一部分，在生物学、文化和商业方面均具有极其重要的意义。次生茎通过为许多其他生命形式提供资源和庇护所而创造了栖息环境。它们还为其所处的生态系统提供多种其他服务，并作为可再生资源用于木材、纸浆、纸张以及其他木质和非木质产品的生产。次生茎的发育，特别是木材形成过程，受到复杂分子系统的调控，这些系统控制着特定细胞类型的发育、细胞壁的生化组成，以及细胞如何排列形成组织和器官。由于多种因素的存在，解析次生茎发育和木材形成的分子基础十分困难，这些因素包括茎内及茎间木材和茎干性状的变异性、较长的世代周期、异花授粉的繁殖系统、高度杂合性、较高的遗传负荷、季节性休眠、成熟性状建立周期长，以及成年树木巨大的物理尺寸。因此，与植物发育其他方面的分子调控机制所具有的详尽知识相比，目前对次生茎发育的理解仍处于初级阶段。
已采用多种体外技术来研究和理解次生维管形成层发育，特别是木材及次生细胞壁的形成过程。这些实验方案涉及使用完整植株或植物部分系统，通过创建转基因植株或转化特定的次生细胞或组织，以研究木材和/或次生茎发育的特定方面1。转基因植株可在遗传转化后从多种植物组织和细胞类型中再生获得，然而进展较为缓慢，尤其是在分析木材纤维性状时，由于再生和茎秆成熟所需时间较长（以年计）、技术与人力投入高、候选基因通量低，以及某些木本植物物种繁殖困难等因素限制了研究效率。在非木本模式系统（如拟南芥）中也已开发出类似技术，成功克服了其中部分限制，但这....
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方案
1. 植物材料的准备
- 实验前，通过种子或插条培育所选树种的幼苗，并将树木培育至拟进行实验的茎部区域直径约为1 cm。
注意：所需时间因植物生长速度而异，因此建议为本步骤预留三到九个月。
2. 双元载体构建
- 在可操作根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的实验室或温室中进行本节至第7节的实验操作，并使用实验室规定的适当个人防护装备。
- 制备一个双元载体，其中包含目的基因的敲低或过表达表达盒，以及一个β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因表达盒；或根据研究类型，将目的启动子与GUS基因融合。
注意：目前有多种双元载体骨架可通过商业渠道或科研网络获得，同时也有多种技术可用于将目的基因或启动子插入双元载体。本实验方案中，如何构建双元载体由实验人员自行决定。 - 通过电穿孔或热激法14将双元载体转化至根癌农杆菌（A. tumefaciens）的无毒菌株中，并妥善保存，待实验时使用。
- 对任何阳性或/和阴性对照重复步骤2.2。
注意：阴性对照应包括在目的基因研究中使用不含目的基因的双元载体，以及在启动子研究中使用无启动子的GUS载体。启动子研究的阳性对照应包含花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35s）与GUS报告基因的融合。
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结果
利用本方案，所有存活的次生分生组织及组织类型均已被证实可被根癌农杆菌（A. tumefaciens）转化，并可根据最初被转化的细胞类型及其后续的发育生长模式划分为不同的扇区类型。扇区类型包括周皮、韧皮部、形成层、创伤薄壁组织和侵填体（图1b、1c、1d），其位置在本段后续内容中有详细描述。周皮扇区由一组仅存在于周皮中且从不延伸至韧皮部的转化细胞组成（图1e）。韧皮部扇区可出现在起始层与周皮之间的不同位置，但从不延伸至这些周围组织中（图1f）。形成层扇区由起始于形成层原始细胞转化而来的木质部/形成层/韧皮部组织构成，可呈现三种不同的模式：i）“完整”形成层扇区，转化的木质部/形成层/韧皮部细胞从创伤薄壁组织边界延伸，穿过木质部和形成层区域，直至包含射线细胞和纺锤状细胞或仅含射线结构的韧皮部组织（图1g）；ii）“原始细胞丢失”形成层扇区，为完整形成层扇区的.......
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讨论
ISSA 方法是一种相对简单且高效的手段，可在数月内创制转基因茎组织，用于分析参与木材和茎形成的基因与启动子。与体外（in vitro）方法相比，该方法在接种后仅需基本的植株存活维护即可生长出转基因茎组织，而体外方法则需要长期培养以维持组织或植株，且木材生成可能需要数年时间才能启动，或无法形成真正的次生茎1。ISSA 方法还已被证明适用于多种树木物种，包括杨属（Populus）、桉属（Eucalyptus）和松属（Pinus）6，以及相思属（Acacia）和伞房属（Corymbia）（数据未显示），在这些物种中几乎无需或仅需极少优化即可获得转基因组织。因此，利用该方法可在大多数目标物种中研究多个感兴趣的基因或启动子。此外，该方案既可单独使用，也可与更常用的体外（in vitro）技术结合使用：可首先通过 ISSA 方法对多个基因进行初步筛选，以鉴定出有潜力的候选基因，再进一步应用于更复杂的体外（in vitro）方法中进行深入研究。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢澳大利亚研究理事会通过链接资助项目 LP0776563（GB、AS）和 LP0211919（GB）以及行业合作伙伴 Sappi 和 Mondi 为本研究的部分工作提供的资金支持，同时感谢澳大利亚研究生奖（EM）以及澳大利亚农业部颁发的青年创新者与科学家奖（LT）。我们还要感谢 Zander Myburg、Qing Wang、Colleen MacMillan 和 Simon Southerton 在本实验方案开发过程中提出的诸多讨论与建议，并感谢 Martin Ranik、Minique De Castro、Julio Najera、Valerie Frassiant、Angelique Manuel 和 Noemie Defaix 在实验室相关工作中提供的协助。
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材料
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| ImageJ图像分析软件 | 可从以下网址获取：http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
参考文献
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinni....
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