Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
Die Säuger Notch – Signalwegs ist homolog zu den gleichen Stoffwechselweg in Drosophila melanogaster und besteht aus vier transmembranen Notch – Rezeptoren (Notch1-4) und fünf membrangebundenen Liganden der Jagged (JAG1 & JAG2) und Delta-like (DLL1, 3, & 4) Familien 1. Notch – Signal wird eingeleitet , wenn Notch – Rezeptor auf einer Empfangszelle , die durch Liganden auf einer Sendezelle 2 gebunden ist. Während dieser trans-Aktivierung, die membrangebundene erzeugt Notch – Liganden eine Streckkraft auf die Membran-gebundenen Notch – Rezeptor 3, 4. Die Dehnkraft der Ligandenbindung induziert Konformationsänderungen in dem Notch-Rezeptor, der von TNFalpha umwandelndes Enzym (TACE) extrazelluläre Spaltung des Rezeptors erleichtern durch ein intrazelluläres Spaltungsereignis von einem Presenilin-enthaltenden gamma-Sekretase-Komplex (γ-Sekretase) vermittelt gefolgt. γ-Sekretase gibt den Notch intracellular Domain (NICD), die in den Zellkern transloziert, wo es eine Transkriptionsaktivierungskomplex bildet mit CBF-1-Su (H) -LAG-1 (CSL), Mastermind-like (MAML) und zelltypspezifische Faktoren die Expression anzutreiben von Zielgenen 5.
Die mechanischen Elemente des Notch – Signalaktivierung Ergebnis in der Notwendigkeit für einzigartige Verfahren der Notch – Signalweg – Aktivierung in vitro. Soluble Notch-Liganden binden an Rezeptoren Notch, aber nicht Dehnungskräfte zu erzeugen, die notwendig für die Freigabe NICD während zugleich kompetitiv die Bindung von zellassoziierte Liganden Notch hemmen. Somit Zugabe von löslichem Notch – Liganden an Kulturmedium können normale Notch dämpfen 6 Signalgebung, 7. Glücklicherweise Notch – Liganden können NICD Freisetzung induzieren , wenn sie 5 zu einem geeigneten starren Substrat befestigt sind, 8, 9,10. Aussäen Zellen auf Liganden-beschichteten Kultursubstrate oder Aufbringen Ligand-beschichteten Kügelchen an Zellen kann sowohl aktivieren Notch-Signalisierung, und die Wahl zwischen ihnen hängt in erster Linie von dem gewünschten Zeitpunkt der Notch-Stimulation. Für sofortige temporäre Notch-Signalaktivierung, wie während der Mittelpunkt einer funktionellen oder Differenzierungsassay, Notch-Liganden an Agarose beads können, zu kultivierten Zellen angewendet würde erwünscht sein, werden gebunden und gewaschen jederzeit aus. Für länger anhalt Notch-Signalisierung von Beginn einer Kulturperiode, Gewebekulturplatten können vor dem Aussähen der Zellen mit dem Liganden überzogen werden.
Für die Zwecke dieses Protokolls werden Verfahren durchgeführt Maus Osteoklastenvorläufer verwenden, aber die Verfahren und Variationen der hier beschriebenen Verfahren sind anwendbar auf eine große Vielzahl von Zelltypen 6, 11, 12, 13, </sup> 14. Osteoklasten sind terminal differenzierten hämatopoetischen linage Zellen , die für die Resorption von Knochengewebe verantwortlich sind, und sie sind in mehreren Erkrankungen des Knochenschwundes 15 gebracht. Somit ist in vitro Untersuchung der Differenzierung von Osteoklasten aus ihren Monocyten / Makrophagen-Abstammungslinie Vorstufen und die molekularen Mechanismen , die Kontrolle ihrer Funktion zu einem besseren Verständnis der Osteoklasten und Entwicklung neuer Knochenregenerierungs Therapien wesentlich ist. Während es nun , dass Notch – Signalweg spielt eine positive Rolle bei der Differenzierung und Funktion von Osteoklasten, Variationen sowohl in der Notch – Signal Stimulation und Osteoklasten – Vorläuferkultur und Differenzierung allgemein akzeptiert wird geführt zunächst widersprüchlichen Ergebnisse 16, 17, 18, 19. Näherer Betrachtung der Unterschiede in den Verfahren und der Verwendung von genetischenModelle haben stark die Rolle der Notch – Signalweg in osteoclastogenesis geklärt, aber Anwendung standardisierter Notch Stimulation und Kulturmethoden könnten solche Kontroversen in zukünftigen Studien der Notch – Signalweg in anderen Zelltypen 20, 21, 22, 23 zu verhindern.
Es gibt mehrere Methoden zum Züchten und Maus Osteoklastenvorläufer Differenzierung und, wie mit unterschiedlichen Methoden zur Stimulierung von Notch-Signalisierung, die beste Methode hängt von der Versuchs Frage abhängen. Hier unsere bevorzugte Methode zur Kultivierung von adhärenten und nicht adhärenten Fraktionen von Mark aus Maus langen Knochen gespült Zellen präsentiert werden. Dieses Verfahren hat den Vorteil, erfordern im wesentlichen keine Spezialausrüstung und Herstellung von Zellen, die zu einer Vielzahl von Differenzierungsmethoden anwendbar sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Kultur und in vitro Differenzierung von Osteoklasten – Vorläufer liefert eine nützliche Plattform für die Untersuchung von molekularen Mechanismen der osteoclastogenesis und Identifizierung von therapeutischen Ziele für die Knochenregeneration und die Erhaltung der Knochenmasse. Wenn Maus Osteoklastenvorläufer Kultivierung ist das wichtigste Element Wartung von Vorläufern in einem naiven Zustand. Als Makrophagen-ähnliche Zellen werden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
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