Стимуляция Signaling Notch у мышей предшественников остеокластов
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
Сигнализацию Паз путь млекопитающим является гомологичной к тому же пути в дрозофилы и состоит из четырех рецепторов трансмембранный надрезом (Notch1-4) и пять связанных с мембраной лигандов зазубренных (jag1 & JAG2) и дельта-типа (Dll1, 3, & 4) семьи 1. Передача сигналов Notch инициируется , когда рецептор Notch на приемной клетке связана лиганда на передающей ячейки 2. Во время этого транс-активации, лиганд Notch мембраносвязанная производит растягивающее усилие на рецептор Notch мембраной 3, 4. Растягивающая сила связывания лиганда вызывает конформационные изменения рецептора Notch, которые облегчают внеклеточный расщепление рецептора с помощью TNF альфа-превращающего фермента (ТАСЕ) с последующим внутриклеточным событием расщепления, опосредованного пресенилин-содержащего гамма-секретазы комплекса (гамма-секретазы). γ-секретазы освобождает INT Notchracellular домен (NiCd), который транслоцирует в ядро, где он образует транскрипционной активации комплекса с CBF-1-Су (H) -Lag-1 (CSL), вдохновителя-подобный (MAML), и факторы конкретного типа клетки для того чтобы управлять экспрессией генов – мишеней 5.
Механические элементы сигнализации Notch результате активации в необходимости уникальных методов активации пути Notch в пробирке. Растворимые лиганды Notch могут связываться с рецепторами Notch, но не приводят к растягивающих сил, необходимых для высвобождения NICD в то время как в то же самое время, конкурентно ингибировать связывание лигандов Notch клеточно-ассоциированной. Таким образом, добавление растворимых лигандов Notch в культуральной среде может ослабить нормальный Notch сигнализации 6, 7. К счастью, лиганды Notch могут индуцировать высвобождение NICD , если они прикреплены к соответствующим жесткой подложке 5, 8, 9,10. Посев клеток на лиганд-покрытием культуральных субстратах или нанесения лиганд-покрытием бусин в клетки могут одновременно активировать передачу сигналов Notch, и выбор между ними зависит прежде всего от желаемого времени стимуляции Notch. Для немедленного, временного активации сигнализации Паз, как можно было бы желательно во время средней точке функциональной или дифференцировки анализа, лиганд Выемка может быть связан с агарозном бисером, наносимые на культивируемые клетки, и вымываются в любое время. Для получения более устойчивой передачи сигналов Notch с начала периода культуры, культуры тканей пластины могут быть покрыты оболочкой с лигандом до начала посева клеток.
Для целей настоящего протокола, способы осуществляются с помощью мыши предшественников остеокластов, но способы и варианты способов , описанных здесь , применимы к широкому разнообразию типов клеток 6, 11, 12, 13, </SUP> 14. Остеокластов неизлечимо дифференцированные гемопоэтические клетки , которые построчная оплата ответственны за резорбции костной ткани, и они участвуют в многочисленных нарушениях потери костной массы 15. Таким образом, в пробирке исследования дифференцировки остеокластов из их моноциты / макрофаги-линии дифференцировки предшественников и молекулярных механизмов , контролирующих их функция имеет важное значение для лучшего понимания остеокластов и развития новых костных-регенерирующий терапии. В то время как в настоящее время принято считать , что передача сигналов Notch играет положительную роль в дифференцировке и функции остеокластов, вариации в обоих Notch стимуляции сигнализации и остеокластов культуры и дифференциации предшественника привела к первоначально противоречивые выводы 16, 17, 18, 19. Более тщательное изучение различий в методах и использования генетическихмодели значительно выяснена роль передачи сигналов Notch в остеокластогенеза, но применение стандартизованных стимуляции Notch и культуры методов может предотвратить такие споры в будущих исследованиях сигналов Notch в других типах клеток 20, 21, 22, 23.
Существуют различные методы для культивирования и дифференциации мыши предшественников остеокластов, и, как и с различными методами стимул ции передачи сигнала Notch, лучший способ будет зависеть от экспериментального вопроса. В данном случае наш предпочтительный способ культивирования адгезивных и неадгезированных фракции клеток костного мозга вымывали из мышиных длинных костей будут представлены. Этот метод имеет то преимущество, что он не требует по существу отсутствие специализированного оборудования и продуцирующие клетки, которые применимы к различным методам дифференциации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках протокола
Культура и в пробирке дифференциации предшественников остеокластов обеспечивает полезную платформу для исследования молекулярных механизмов остеокластогенеза и идентификации терапевтических мишеней для регенерации костной ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it?. Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
