마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Summary

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

Abstract

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.

Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.

This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Introduction

포유류 노치 신호 전달 경로는, 초파리 melanogaster의에서 동일한 경로에 상동이며, 네 횡단 노치 수용체 (Notch1-4) 및 가변 (JAG1 및 JAG2) 및 델타처럼 (DLL1, 3의 다섯 막 결합 리간드로 구성 및 4) 가족 ^(1). 수신 셀에 노치 수용체가 투과 ^셀이 리간드에 의해 결합 될 때 노치 신호 전달이 개시된다. 이 트랜스 활성화 중에 막 결합 노치 리간드는 막 결합 수용체의 노치 ^{(3, 4)에} 인장력을 생성한다. 리간드 결합의 인장력은 프레 함유 감마 – 세 크레타 제 복합체 (γ 세 크레타 제)에 의해 매개되는 세포 내 절단 이벤트 뒤에 효소 (TACE)에 변환 TNF- 알파에 의해 수용체의 세포 분열을 촉진 노치 수용체의 구조적 변화를 유도한다. γ 세 크레타 자료 노치 INT이 CBF -1- 쓰 (H) – lag 여기서 -1- (CSL), 배후 형상 (MAML)과 전사 활성 복합체를 형성하는 핵으로 전위 시키며, 세포 유형 특이 적 인자 발현을 구동 racellular 도메인 (NICD) 유전자 ^{5를 대상으로.}

시험관 내에서 노치 경로의 활성화 방법의 고유 한 필요성 노치 신호 전달 활성 결과의 기계적 요소. 가용성 노치 리간드는 수용체를 노치에 결합하지만, 동시에 경쟁적으로 세포 관련 노치 리간드의 결합을 억제하면서 NICD 해제에 필요한 힘을 스트레칭 생산하기 위해 실패 할 수 있습니다. 따라서, 배양 배지에 용해 노치 리간드 첨가 ^{6,7 시그널링} 정상 노치를 감쇄 할 수있다. 이들이 적절 리지드 기판 ^{(5), (8, 9)에} 고정되는 경우 다행히도 노치 리간드 NICD 방출을 유도 할 ^{수있다,10.} 리간드 피복 된 배양 세포를 기판 상에 시드 또는 세포 리간드 피복 된 비드를 적용 모두 노치 신호를 활성화하고, 그들 사이의 선택은 노치 자극 원하는 타이밍에 주로 의존 할 수있다. 기능 분석 또는 분화의 중간 동안 소망되는 바와 같이 즉각적인 임시 노치 신호의 활성화를 들어, 노치 리간드는 배양 된 세포에 적용 비드를 아가 로스에 바인딩 될 수 있고 언제든지 세척. 배양 기간의 시작 부분에서 더 지속 노치 시그널링, 조직 배양 플레이트를 세포 시딩 이전 리간드로 코팅 될 수있다.

이 프로토콜의 목적을 위해, 방법은 마우스 파골 세포 전구체를 사용하여 수행되지만, 여기에 기술 된 방법에 대한 방법과 유사 세포 타입 ^{6, 11, 12, 13의} 다양한 ^{적용하고,} </SUP> ^14. 파골 세포는 말단 골 조직의 재 흡수에 대한 책임 분화 조혈 세포 계보이며, 그들은 골 소실 ^(15)의 여러 질환에 연루되어있다. 따라서, 자신의 단핵구 / 대 식세포 계통의 전구 물질로부터 파골 세포와 그 기능이 파골 세포와 새로운 뼈 재생 치료의 개발의 더 나은 이해에 필수적인 제어하는 분자 메커니즘의 분화의 생체 외 연구한다. 지금 일반적 해당 노치 시그널링은 파골 세포의 분화와 기능에 긍정적 인 역할을 허용하는 동안, 모두 노치 신호 자극 및 파골 세포 전구체의 배양과 분화의 변화는 초기 상반된 결과 ^{16, 17, 18, 19되었다.} 가까이 방법의 차이 검사와 유전자의 사용모델은 크게 파골 노치 신호 전달의 역할을 명확히했지만, 표준화 노치 자극 배양 방법의 적용은 다른 세포 유형 ^{20, 21, 22, 23} 노치 신호의 향후 연구에서 이러한 논쟁을 방지 할 수있다.

노치 신호 전달을 자극위한 다양한 방법과 같이, 가장 좋은 방법은 실험 문제에 달려있다 배양 마우스 파골 세포 전구체의 분화를위한 여러 방법이 있으며. 여기서, 마우스 긴 뼈에서 플러시 골수 세포의 부착 및 비 부착 분수를 배양하는 우리의 선호하는 방법이 표시됩니다. 이 방법은 분화 된 다양한 방법에 적용 할 수있는 세포를 본질적으로 특별한 장비가 필요없고, 제조의 이점을 갖는다.

Protocol

척추 동물과 관련된 모든 연구는 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 1. 문화 미디어 준비 100 ml의 열, 900 ML의 H 2 O의 최소 필수 배지 (MEM) 분말 1.9 g의 탄산 수소 나트륨을 용해하여 α-MEM을 준비하고 2 mM L- 글루타민, 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신과 보완 불 활성화 된 소 ?…

Representative Results

이 방법의 목적은 문화이며, 파골 세포 전구체에 노치 신호를 자극한다. 때 제대로 배양, 파골 세포 전구체는 부드러운 세포질 (그림 1A)와 주로 긴 스핀들 모양의 형태를 나타낸다. 주의가 파골 세포 전구체의 면역 활성화를 피하기 위해주의해야한다. 활성화되면, 전구체 확산과 거품 세포질 (그림 1B)로 평평하게됩니다. 이러한 "기름에 튀긴 ?…

Discussion

프로토콜 내에서 중요한 단계

문화와 파골 세포 전구체의 체외 분화는 파골 세포 및 골 재생과 뼈 질량의 보존을위한 치료 대상의 식별 분자 메커니즘의 조사를위한 유용한 플랫폼을 제공합니다. 마우스 파골 세포 전구체를 배양 할 때, 가장 중요한 요소는 나이브 상태의 전구체를 유지한다. 마크로파지 유사 세포로, 파골 세포 전구체는 박테리아 성분 및 염증성 사이토…

Materials

Recombinant mouse M-CSF	Biolegend	576402	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant mouse RANKL	Shenandoah Biotechnology	200-04	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Recombinant human Jagged1-Fc	R&D Systems	1277-JG-050	Available from multiple suppliers, test activity before experiments
Protein G agarose beads	InvivoGen	gel-agg-2
Goat anti-human IgG Fc	Jackson ImmunoResearch	109-001-008
Minimum Essential Medium powder	Sigma-Aldrich	M0894
Accutase cell dissociation reagent	ThermoFisher	A1110501	Used to lift osteoclast precursors
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT	Used to stain differentiated osteoclasts