Первоначальная оценка антител конъюгаты изменения с пептидами вирусный производные для повышения сотовой накопления и ориентации опухоли

Summary

Вирусные производные пептиды, в сочетании с антител конъюгатов (ACs) — это подход, набирает обороты из-за возможности доставлять молекулярной аппаратуру с накоплением рост опухолевых клеток. Используя общие методы для оценки пептид спряжение, переменного тока и полезной нагрузки внутриклеточного накопления и опухоли таргетинга, этот протокол помогает исследователям на этапах первоначального развития.

Abstract

Антитела конъюгатов (АКГ) изменен с пептидами, вирус производные являются потенциально мощный класс опухолевых клеток агентов доставки для молекулярной нагрузок используется в лечении рака и изображений из-за увеличения сотовой накопления над текущей ACs. Во время ранних переменного тока в vitro развития, методы флуоресценции и Радиоиммуноанализы достаточно для определения внутриклеточной локализации, накопление эффективность и специфики целевой ячейки. В настоящее время нет консенсуса на стандартизированные методы подготовки клетки для оценки AC внутриклеточного накопления и локализации. Первоначальное тестирование ACs с вирусом производные пептиды имеет решающее значение, особенно если были построены несколько кандидатов. Определение внутриклеточного накопления флуоресценции могут быть затронуты фонового сигнала от ACs на поверхности клеток и усложнить толкование накопления. Для Радиоиммуноанализы фракционированный обычно обработанные клетки и измерения радиоактивности в различных клеточных компартментов. Однако лизис клеток зависит от ячейки к ячейке и часто ядерные и цитоплазматические отсеков не адекватно изолированы. Это может производить вводящие в заблуждение данные о свойствах доставки полезной нагрузки. Внутривенные инъекции radiolabeled вирус производные пептид модифицированные ACs в опухоли, принимая мышей, следуют радионуклидной визуализации-это мощный метод для определения свойства доставки опухоли ориентации и полезной нагрузки в в естественных условиях этапа развития. Однако это относительно недавнее улучшение и несколько групп оценивается вирус производные пептид модифицированные ACs таким образом. Мы описываем обработки обработанные клетки более точно оценить вирус производные пептид модифицированные накопление переменного тока при использовании confocal микроскопии и Радиоиммуноанализы. В частности метод trypsinizing клетки, чтобы удалить поверхности клетки связаны ACs. Мы также предоставляют метод для улучшения клеточной фракционирования. Наконец этот протокол предоставляет метод в естественных условиях с использованием позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) для оценки первоначальной опухоли, ориентация свойства опухоли подшипник мышей. Мы используем радиоизотопные ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 ч) как полезные данные примера в настоящем Протоколе.

Introduction

Антитела конъюгатов (АКГ) являются биофармацевтических препаратов, которые созревают в класс трансформативных эффективных препаратов для улучшения лечения рака и для обнаружения опухолей. Состоит из моноклональных антител (МАБ), конъюгированных с молекулярной полезных радиоизотопов, малые молекулы и биологических токсинов, ACs способны доставить этих полезных для раковых клеток с изысканной целевой антигена сродства и специфичностью. Таким образом ACs могут значительно сократить неспецифических токсичности и увеличения полезной деятельности на объекте опухоли. Терапевтически ACs, транспортировки цитотоксических малых молекул (обычно упоминается как антитела наркотиков конъюгатов) были одобрены для лечения пациентов с раком молочной железы и лимфомы Ходжкина, которые потерпели неудачу традиционные методы лечения ^{1, 2}. Кроме того, перевозящих радиоизотопов ACs (обычно называют radioimmunoconjugates) также находятся в стадии разработки. Переменного тока транспортировки радиоизотопов для визуализации предназначено для выявления метастазов рака простаты ³. С многие терапевтический ACs, представленный для утверждения ⁴оптимизм является высоким для будущего ACs для улучшения рака уход ⁵.

Тем не менее при доставке химиотерапевтические или радиоизотопов, ACs испытывают трудности, эффективно накапливать эти полезных нагрузок внутри клеток-мишеней. Этот аспект значительно способствует во многих случаях в неспособности ACs предоставлять долгосрочные безвирусного выживания или опухоль высококонтрастных изображений ^6,7. В общем после того, как ACs привязать их целевой антиген они являются внутренним через процесс, известный как рецептор опосредованный эндоцитоз. ACs затем ловушке внутри endosomes и торговли для лизосомы деградации и грузоподъемность выпуска ⁸. Процесс внутриклеточного торговли создает проблемы для ACs для достижения высокой полезной специфика и эффективность против раковых клеток-мишеней. Например, многие антигены например Her2 (целевой показатель для терапевтического AC трастузумаб emtansine) можно перерабатывать до 85% связанного антител в первые 30 мин ⁹. Кроме того после того, как происходит деградация, выпущенный химиотерапевтические и радиоизотопов могут активно экспортироваться увеличение выражение или активность мембранных связанные транспортных белков ^10,11. Лизосома деградации также препятствует оказанию полезных новых биологических такие терапевтические ферментов и олигонуклеотиды, которые могут быть отключены ^12,13. По существу раковые клетки очень эффективен при отмены необходимые внутриклеточное накопление полезных предоставляемых ACs.

Этот протокол описывает способы реализации концепции ACs связаны с вирусом производные пептиды, специально для побега endosome изобличения и локализации клеточное ядро. С такой сложности манипулировать принимающей ячейки системы это не удивительно, что развитие вируса производных белков и пептидов как потенциальных биофармацевтики давно были укоренившиеся в терапевтических исследованиях ¹⁴. За миллионы лет вирусы эволюционировали, чтобы приобрести исключительную коллекцию белки способны использовать нормальное физиологическое mammalian клетки систем для того, чтобы эффективно ввести клеток хозяина. Для вирусов, которые являются внутренним через рецептор опосредованный эндоцитоз они также сталкиваются с побега людьми Лизосома где натиском локализованных концентрации протеаз может быть проблематичным для выживания. Хорошо характеризуется вирусный производные пептид, используемых в доставки лекарств для экранирования endosome захвата является transactivator вирусом иммунодефицита человека транскрипции (ТАТ) белок ¹⁵. ТАТ состоянии избежать захвата endosome путем зондирования низкий рН в какой-то момент белка конформационные изменения происходят благоприятные ТАТ вставить себя в и сорвать от англ мембраны ¹⁶. Это приводит к Tat грузоподъемность конъюгатов возможность доступа к цитоплазме. Второй элемент вирусный манипуляции, связанные с этот протокол является подход, используемый для доставки терапевтических генов и наркотики ядро ¹⁷. Вирусы эволюционировали, чтобы успешно управлять принимающей ячейки машины для прогрессирует в прошлом ядерной мембраны, проходя через ядерные поры комплекс (NPC). Сотовый макромолекул содержат (или связываться с белками, которые содержат) ядерной локализации сигналов (ОУЖН), необходимые для привязки к ядерной транспорт белков (например karyopherins α и β), которые обеспечивают необходимые движения через NPC. Вирусы были разработаны протеины содержат последовательности NLS, которые предоставляют им возможность использовать принимающей ячейки транспортных белков для попеременно в ядро ¹⁸.

Многочисленные ACs ранее были функционализированных с ТАТ – и NLS-производные пептидами и испытаны для их способность накапливаться внутри раковых клеток и для ориентации опухоли ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (Таблица 1). Исследования, обеспечивая цитотоксических полезных показали, что ACs с вирусом производные пептиды способны значительно увеличить сотовой накопления, цитотоксичность и опухоли, убив над неизмененной ACs ^22,26. Общей чертой для этого романа класса переменного тока является их строительства. Как правило пептиды содержат терминала цистеина, обеспечивая свободный сульфгидрильных групп. MAbs сначала отреагировали с noncleavable бифункциональных сшивателя, содержащей N– оксисукцинимидного (ГСЗ) и maleimide групп на противоположных концах. NHS эфиры реагируют с первичных аминов МАБ сформировать амидных связей. МАБ отреагировал с бесплатным maleimide группами затем реагирует с сульфгидрильных групп на пептиды, сформировать тиоэфиром Бонд и таким образом увязка пептида и МАБ. Хотя homobifunctional сшиватели используется ²⁸, heterobifunctional сшивателя более широко используются в строительстве вирус производные пептид ACs ^{22,23,26, 31,32}. Этот протокол использует специально сшивателя sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу ККАП) за его простоту использования и потому, что он используется в утвержденных антитела наркотиков конъюгата трастузумаб emtansine и во многих вирус производные пептид ACs ^{8,22,23,26,,3132}. Электрофорез геля полиакриламида сульфата натрия Додециловый (SDS-PAGE) является основным методом для первоначально определения эффективности спряжение и полу количественного определения количество пептидов в МАБ. Конфокальная микроскопия помощью дневно меченых вторичное антитело для mAb обычно является метод первоначально оценки свойства внутриклеточного распространения вируса производные пептид модифицированные АКГ. До настоящего времени радиоизотопов являются основной полезной нагрузки, выступил вирус производные пептид модифицированные ACs. Радиоизотопов, выгодно, потому что радиоактивности в клетках легко количественно подсчитывая гамма. Кроме того служба управления доступом, которые переводятся на мыши модели человеческого рака обеспечивают исследователей с возможностью оценить опухоли ориентации с использованием молекулярной визуализации формы, такие, как одиночных фотонов выбросов компьютерная томография и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) ^{23 , 32 , 33}. В целом, строительство и тестирование методов, в основном используется исследователями проверки обеспечивают очень хорошую оценку АКГ изменен с пептидами, вирус, полученных на этапе первоначальной разработки эффективно войти и доставить Полезная нагрузка, внутри клетки-мишени и целевой опухоли.

Tat-NLS-изменены и ACs есть Подсветка ключевых областей для дальнейшего улучшения доставки полезной нагрузки внутри клетки рака и опухолей. Отношении NLS-модифицированные ACs эффективность в внутриклеточного накопления может быть скромным ^23,,3134. Неэффективные внутриклеточного накопления вызвана захвата продолжение от англ. В естественных условиях ориентации опухоли также может быть ослаблена с обеих ТАТ – и NLS-изменение ACs. Несколько положительных заряженных остатков содержат активные последовательности ТАТ и NLS. При подключении к mAbs, Общая катионного заряда может быть значительно увеличили ³⁵. Как следствие ТАТ-NLS-изменены и ACs увеличили поглощения в здоровых тканях и увеличенный просвет быстрой крови.

Наша группа разработала композитные смеси состоящей из Холевая кислота связана с NLS (ChAcNLS; Рисунок 1). ChAcNLS изменение ACs способны увеличить внутриклеточного накопления поставленный радиоизотопов и улучшить опухоль ориентации, по сравнению с NLS-модифицированные и традиционных ACs ^33,34. Механизм позади Холевая кислота вдохновлен способности выбора nonenveloped вирусы, которые не могут полагаться на мембраны Фьюжн использовать Холевая кислота для инициирования endosome бежать через формирование Церамид. К примеру свиного кишечного вируса новобранцев Холевая кислота, которая активирует sphingomyelinase, который катализирует гидролиз сфингомиелин в Церамид ^36,,3738. Это дестабилизирует от англ мембраны и позволяет вирус побег. Таким образом Холевая кислота является другой вирус производный компонент, который дополняет NLS.

Как это поле движется вперед и будущих достижений происходят в полезных данных доставки службой ACs с вирусом производные пептиды, это подходящее время для обеспечения визуального демонстрации их биохимических и функциональных характеристик во время начальной разработки. Здесь мы описываем наш протокол для первоначальной оценки вирус производные пептид модифицированные ACs для определения эффективности еще простой внутриклеточного накопления и опухоли ориентации во время ранней стадии развития. Мы используем имеющиеся mAbs 7G 3 и A14 как пример модели системы. 1 процедура описывает использование SDS-PAGE как метод, который позволяет для «go/no go» решений для сконструированного ACs. Процедура 2 описывает метод, с помощью trypsinization, позволяя для улучшения визуализации AC внутриклеточного распределения и накопления. Процедура 3 описывает метод для повышения внутриклеточного фракционирование точно определить ядерной локализации. В этой процедуре мы используем грузоподъёмность ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 ч) потому что он уязвим для сотовых измеряем и позитрон излучателя ¹⁰. Таким образом процедура 4 описывает в vivo опухоли ориентации характеристика ПЭТ изображения для визуализации опухоли поглощения относительно фона (т.е. здоровых тканей nontarget) и определить, может ли пример переменного тока непосредственно и эффективно Целевой опухоли. Эти методы являются достаточно для следователей развивающихся ACs с вирусом производные пептиды для выявления кандидатов для дальнейшего продвижения.

Protocol

В естественных условиях животных описал были проведены эксперименты согласно утвержденным протоколом и этические руководящие принципы Комитета по этике при университетский центр де Шербрук для экспериментов животных. 1. антитела пептида спряжение П…

Representative Results

1 процедура строительство 7G 3 изменена с ChAcNLS с помощью сульфогруппу ККАП как сшивателя является очень надежным. Как правило при загрузке на 12% гель и проанализированы SDS-PAGE, это приводит к различимых поэтапное увеличение МВт пропорционального увеличения соотношения су…

Discussion

Основными задачами системного доставки анти-рак агентов являются увеличить накопления на опухоли и поглощение в раковые клетки и уменьшить нежелательные побочные эффекты в здоровых тканях. AC целевой доставки молекулярных полезных для опухолевых клеток является весьма перспективным…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771