Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Summary

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Abstract

Conjugados de anticuerpos (ACs) modificados con péptidos derivados de virus son una clase potencialmente poderosa de tumor de la célula entrega agentes de cargas moleculares utilizadas en el tratamiento del cáncer y la proyección de imagen debido a la creciente acumulación celular sobre ACs actual. Durante el temprano AC en vitro desarrollo, técnicas de fluorescencia y radioinmunoanálisis son suficientes para determinar la localización intracelular, la acumulación eficiencia y especificidad de la célula blanco. En la actualidad, no existe consenso en los métodos estandarizados para la preparación de las células para evaluar la localización y acumulación intracelular de AC. Las pruebas iniciales de ACs modificado con péptidos derivados de virus es fundamental sobre todo si se han construido varios candidatos. Determinar la acumulación intracelular de fluorescencia puede ser afectado por la señal de fondo de ACs en la superficie celular y complicar la interpretación de la acumulación. Para radioinmunoanálisis, células tratadas normalmente se fracciona y midió la radiactividad en compartimentos celulares diferentes. Sin embargo, lisis celular varían de célula a célula y compartimientos a menudo citoplasmáticos y nucleares no están adecuadamente aislados. Esto puede producir la engañosos datos sobre propiedades de entrega de carga. La inyección intravenosa de radiactivos ACs de péptido modificado derivado de virus en ratones seguidos por gammagrafía del cojinete del tumor es un método eficaz para determinar propiedades de tumor targeting y carga entrega en la fase de en vivo de desarrollo. Sin embargo, esto es un avance relativamente reciente y pocos grupos han evaluado derivados de virus ACs péptido modificado de esta manera. Describimos el tratamiento de células tratadas para evaluar con mayor precisión derivados de virus modificado de péptido AC la acumulación cuando se utiliza el radioinmunoanálisis y microscopía confocal. Específicamente, un método para quitar la superficie de la célula de las células trypsinizing bound ACs. También proporcionamos un método para mejorar el fraccionamiento celular. Por último, este protocolo proporciona un método en vivo utilizando tomografía por emisión de positrones (PET) para evaluar el tumor inicial dirigida a propiedades en ratones con tumores. Utilizamos el radioisótopo ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) como una carga de ejemplo en este protocolo.

Introduction

Conjugados de anticuerpos (ACs) son productos biofarmacéuticos que están madurando en una clase transformadora de medicamentos eficaces para mejorar los tratamientos contra el cáncer y para detectar tumores. Compuesta por un anticuerpo monoclonal (mAb) conjugado con la moleculares cargas tales como radioisótopos, moléculas pequeñas y las toxinas biológicas, ACs son capaces de entregar las cargas útiles a las células cancerosas con destino exquisito antígeno afinidad y especificidad. Así, ACs tienen el potencial para reducir toxicidad inespecífica considerablemente y aumentar la actividad de carga en el sitio del tumor. Terapéutico, ACs transporte citotóxicas moléculas pequeñas (comúnmente contempladas como fármacos de anticuerpos conjugados) han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama y linfoma de Hodgkin, que han fracasado los tratamientos convencionales ^{1, 2}. Además, radioisótopos transporte ACs (comúnmente contempladas como radioimmunoconjugates) también están en desarrollo. CA transporte de radioisótopos para la proyección de imagen está aprobado para la identificación de metástasis de cáncer de próstata ³. Con muchos ACs más terapéutico presentado para aprobación ⁴, el optimismo es alto para el futuro de ACs para mejorar la atención de cáncer ⁵.

Sin embargo, cuando ofrecer quimioterapia o radioisótopos, ACs tener dificultad con eficacia acumulando estas cargas dentro de las células diana. Este aspecto contribuye significativamente en muchos casos la imposibilidad de ACs para proporcionar larga duración de supervivencia libre de enfermedad o tumor de alto contraste proyección de imagen de ^6,7. En general, una vez que ACs se unen su antígeno blanco se internalizan a través de un proceso conocido como endocitosis mediada por receptor. Los ACs son atrapados dentro de endosomas y trata a los lisosomas para su degradación y liberación de carga ⁸. El proceso de tráfico intracelular plantea desafíos para el ACs lograr una carga alta especificidad y eficacia contra las células cancerosas de destino. Por ejemplo, muchos antígenos como Her2 (target para terapéutica AC Trastuzumab-emtansine) puede reciclar hasta un 85% de los anticuerpos encuadernados en los primeros 30 min ⁹. Además, una vez que se produce degradación, quimioterápicos liberado y radioisótopos pueden ser activamente exportados por aumento de la expresión o actividad de transporte de membrana asociada proteínas ^10,11. Degradación del lisosoma también impide la entrega de novela cargas biológicas tales como enzimas terapéuticas y oligonucleótidos que pueden ser desactivado de ^12,13. En esencia, la célula cancerosa es altamente efectiva en abrogar la necesaria acumulación intracelular de cargas por ACs.

Este protocolo describe cómo implementar el concepto de ACs-unida a péptidos derivados de virus, especialmente para escapar captura endosome y localizar al núcleo celular. Con tal sofisticación para manipular sistemas host de la célula, no es sorprendente que el desarrollo de péptidos y proteínas derivadas del virus como potenciales biofármacos durante mucho tiempo ha sido arraigado en investigación terapéutica ¹⁴. Durante millones de años los virus han evolucionado para adquirir una colección excepcional de proteínas capaces de explotar los sistemas fisiológico normal de la célula mamífera para entrar eficazmente en las células del huésped. Para virus que son internalizados por endocitosis mediada por receptor, son también desafiaron con escape trata al lisosoma donde el embate de una concentración localizada de proteasas puede ser problemático para la supervivencia. Un bien caracterizado péptido viral derivados utilizado en la entrega de la droga para escapar captura endosome es el virus de inmunodeficiencia humana transactivator de transcripción (Tat) proteína ¹⁵. TAT es capaz de escapar captura endosome detectando en qué punto cambios conformacionales de la proteína ocurren Tat propicio para insertarse en y alterar la membrana endosomal del ¹⁶de pH bajo. Esto resulta en conjugados de Tat-carga útil acceder al citoplasma. El segundo elemento de manipulación viral relacionada con este protocolo es el enfoque utilizado para entregar genes terapéuticos y medicamentos para la de núcleo ¹⁷. Virus han evolucionado para manipular con éxito maquinaria de la célula huésped para progresar más allá de la membrana nuclear pasando a través del poro nuclear complejo (NPC). Macromoléculas celulares contienen (o se unen a proteínas que contienen) transportan de señales de localización nuclear (NLSs) necesarias para atar a nuclear proteínas (e.g. carioferinas α y β), que proporcionan los movimientos requeridos a través de la APN. Virus han desarrollado proteínas para contener secuencias NLS que les proporcionen la capacidad para utilizar proteínas de transporte de la célula anfitrión para realizar la transición en el núcleo ¹⁸.

Numerosos ACs previamente han sido funcionalizados con péptidos derivados de Tat y NLS y probados por su capacidad para acumular dentro de las células cancerosas y para apuntar tumores ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (tabla 1). Entrega de cargas citotóxicos los estudios han demostrado que ACs modificado con péptidos derivados de virus son capaces de aumentar significativamente la acumulación celular, citotoxicidad y tumor matando sobre si ACs ^22,26. Una característica común de esta nueva clase de AC es su construcción. Por lo general, péptidos contienen una cisteína terminal proporciona un grupo sulfhidrilo libre. MAbs se reaccionó primero con un crosslinker bifuncional de noncleavable que contiene N– hydroxysuccinimide (NHS) y grupos de maleimida en extremos opuestos. Los ésteres de NHS reaccionan con aminas primarias en el mAb para formar enlaces amida. El mAb reaccionado con los grupos de maleimida gratis es entonces reaccionado con los grupos sulfhidrilo de los péptidos para formar un thioester enlace y así une el péptido y el mAb. Aunque homobifunctional reticulados han utilizado ²⁸, heterobifunctional crosslinker son más comúnmente utilizados en la construcción de ^22,23,de péptido derivado de virus-ACs^{26, 31,32}. Este protocolo utiliza específicamente el crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) por su facilidad de uso y porque se utiliza en el conjugado de anticuerpo-medicamento aprobado Trastuzumab-emtansine y en muchos ^{22, 8,23,26,}de péptido derivado de virus-ACs de^31,32. Electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) es el método principal para determinar inicialmente la eficiencia verbal y para la cuantificación del número de péptidos por mAb. La microscopia confocal utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia específico para el mAb suele ser el método para evaluar inicialmente la propiedades de la distribución intracelular de ACs de péptido modificado derivado de virus. Hasta el momento, radioisótopos son las cargas primarias por virus derivados péptidos modificados ACs. Radioisótopos son ventajosas porque la radioactividad en las células se cuantifica fácilmente contando gamma. Además, ACs que se traducen en modelos de ratón de los cánceres humanos proporcionan los investigadores con la capacidad de evaluar tumor targeting mediante modalidades de proyección de imagen moleculares, tales como emisión de fotón único tomografía computada y tomografía por emisión de positrones (PET) ^{23 , 32 , 33}. en general, la construcción y validación de métodos utilizados principalmente por los investigadores de pruebas proporcionan una muy buena evaluación de ACs modificado con péptidos derivados de virus durante la fase de desarrollo inicial con eficacia y entregar los capacidad de carga interior de las células diana y atacan tumores.

TAT y NLS-modificado ACs tienen iluminadas áreas clave para mejorar aún más la entrega de la carga útil dentro de las células cancerosas y tumores. Con respecto a ACs NLS-modificado, la eficiencia en la acumulación intracelular puede ser modesta ^23,31,34. Ineficaz acumulación intracelular es causada por compresión continuada endosomal. En vivo tumor targeting puede también disminuir con tanto Tat y NLS-modificado ACs. Las secuencias activas de Tat y NLS contienen varios residuos cargados positivas. Cuando sujeta a mAbs, la carga total catiónica puede ser significativamente mayor de ³⁵. Como consecuencia, el Tat y NLS-modificado ACs han aumentado absorción en tejidos sanos y aumenta la separación rápida de la sangre.

Nuestro grupo desarrolló un compuesto compuesto compuesto de ácido cólico relacionado con NLS (ChAcNLS; Figura 1). Modificado de ChAcNLS ACs son capaces de aumentar la acumulación intracelular de radioisótopos entregados y mejorar tumor targeting en comparación con el tradicional y modificado de NLS ACs ^33,34. El mecanismo detrás de ácido cólico se inspira en la capacidad de seleccionarlos nonenveloped virus que no puede confiar en la fusión de la membrana a utilizar ácido cólico para activar endosome escape a través de la formación de ceramida. Por ejemplo, virus entérico porcino reclutas de ácido cólico que activa la esfingomielinasa, que cataliza la hidrólisis de esfingomielina a ceramida ^36,37,38. Esto desestabiliza la membrana endosomal y permite el escape del virus. Así, el ácido cólico es otro componente derivado de virus que complementa NLS.

Como este campo se mueve hacia adelante y el futuro los avances se producen en la entrega de la carga de ACs con péptidos derivados de virus, es un momento oportuno para ofrecer las manifestaciones visuales de sus características bioquímicas y funcionales durante el desarrollo inicial. Aquí, describimos nuestro protocolo para la evaluación inicial de los derivados del virus modificado de péptido ACs para la determinación simple pero eficaz de acumulación intracelular y tumor orientación durante el desarrollo temprano de la etapa. Usamos los mAbs comercialmente disponibles 7 3 y A14 como sistemas modelo de ejemplo. Procedimiento 1 describe el uso de SDS-PAGE como un método que permite las decisiones ‘ go/no go’ de ACs construido. Procedimiento 2 describe un método mediante tripsinización permitiendo mejor visualización de la acumulación y la distribución intracelular de AC. Procedimiento 3 describe un método para mejorar fraccionamiento intracelular determinar con precisión la localización nuclear. En este procedimiento utilizamos la carga ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12,7 h) ya que es vulnerable a la emanación celular y es un emisor de positrones ¹⁰. Así, 4 procedimiento describe en vivo tumor a caracterización por animal doméstico proyección de imagen para visualizar la captación del tumor en relación con el fondo (es decir, tejidos sanos no objetivo) y determinar si el ejemplo AC puede específicamente y con eficacia atacan tumores. Estos métodos son suficientes para los investigadores desarrollar ACs modificado con péptidos derivados de virus para identificar a candidatos para más adelanto.

Protocol

Los en vivo animal experimentos descritos se realizaron según un protocolo aprobado y bajo las normas éticas del Comité de ética de la Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke en experimentos animales. 1. anticuerpo péptido verbal Nota: ChAcNLS puede sintetizarse en cualquier fabricante comercial péptido o plataforma de servicio de síntesis de péptido Universidad-afiliado. La síntesis de ChAcNLS puede encontrarse en la referencia <sup class="xr…

Representative Results

Para el procedimiento 1, la construcción de 7 3 modificado con ChAcNLS uso de sulfo-SMCC como un crosslinker es muy confiable. Por lo general, cuando se cargan en un gel de 12% y analizadas por SDS-PAGE, esto se traduce en aumentos progresivo distinguibles en MW proporcional al aumento de ratios de sulfo-SMCC-a – 7 3 usa y permite para que las cadenas pesadas y ligeras para evaluarse individualmente para ChAcNLS verbal (figura 3). 7G 3 reaccionaron en 10, 20, 25-y ratios…

Discussion

Objetivos principales de la entrega sistémica de agentes contra el cáncer son aumentar la acumulación en el sitio del tumor y la absorción dentro de las células cancerosas y reducir los efectos secundarios no deseados en los tejidos sanos. Entrega de AC dirigido de cargas moleculares a las células tumorales es un enfoque muy prometedor para tratar y detectar tumores. Sin embargo, la falta de eficacia causada por atrapamiento del endosome y por degradación lisosomal de corriente sigue siendo un reto importante. Si …

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771