باستخدام مستقبلات الموسومة pHluorin لمراقبة التحت خلوية التعريب والاتجار
Summary
وسم المجال خارج الخلية من بروتين الغشاء مع fluorophore حساسة درجة الحموضة، superecliptic pHluorin (سبتمبر)، ويتيح توطين التحت خلوية، والتعبير، والاتجار يحدد لاحقا. البروتينات التصوير سبتمبر وصفت مع الانعكاس الكلي الداخلي مضان المجهر (TIRFM) تمكن الكمي لمستويات البروتين في الطرفية ER والبلازما الغشاء.
Abstract
فهم غشاء الاتجار البروتين، والتجمع، والتعبير يتطلب المنهج الذي يفرق بين المقيمين في العضيات داخل الخلايا وتلك المترجمة على غشاء البلازما. القياسات التقليدية القائمة على مضان تفتقر إلى القدرة على تمييز البروتينات غشاء المقيمين في العضيات المختلفة. قطع منهجيات حافة تتجاوز الطرق التقليدية التي اقتران fluorophores الحساسة درجة الحموضة مع مجموع المجهر التأمل الداخلي مضان (TIRFM). TIRF الإضاءة يثير عينة تصل إلى ما يقرب من 150 نانومتر من واجهة الزجاج العينة، مما يخفض الخلفية، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتعزيز القرار. حجم الإثارة في TIRFM يشمل غشاء البلازما والعضيات المجاورة مثل ER الطرفية. Superecliptic pHluorin (سبتمبر) هو نسخة حساس درجة الحموضة من GFP. وراثيا ترميز سبتمبر في المجال خارج الخلية من البروتين غشاء من الفائدة المواقف وfluorophore علىالجانب اللمعية من لائحة وفي المنطقة خارج الخلية للخلية. سبتمبر هو فلوري عند الرقم الهيدروجيني أكبر من 6، لكنها لا تزال في حالة الخروج على قيم الرقم الهيدروجيني أقل. لذلك، مستقبلات ذات الكلمات الدلالية مع سبتمبر يتألق عند إقامتهم في الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) أو على الإدراج في غشاء البلازما (بعد الظهر)، ولكن ليس عندما يقتصر على الحويصلة الاتجار أو غيرها من العضيات مثل جولجي. الرقم الهيدروجيني خارج الخلية يمكن تعديلها لإملاء مضان من المستقبلات على غشاء البلازما. الفرق في مضان بين الصور TIRF في الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة والحمضية لنفس الخلية يتطابق مع العدد النسبي للالمستقبلات على غشاء البلازما. هذا يسمح للقياس في وقت واحد من مستقبلات المقيمين داخل الخلايا وغشاء البلازما. كما يمكن قياس الأحداث حويصلة واحدة الإدراج عند الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة، الموافق منخفضة حويصلة الاتجار درجة الحموضة الصمامات مع غشاء البلازما والانتقال إلى دولة الفلورسنت. هذا versatilيمكن استغلالها تقنية ه لدراسة الترجمة، والتعبير، والاتجار بها بروتينات الغشاء.
Introduction
وقد تم ربط التغيرات في التعبير مستقبلات والتوزيع والتجميع لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والتليف الكيسي، وإدمان المخدرات 1، 2، 3، 4، 5. على سبيل المثال، النيكوتين وغيرها بروابط النيكوتين يؤثر على الاتجار مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية (nAChRs) مما يؤدي إلى تغيرات في الاتجار والتعبير، وupregulation 1، 2، 5، 6، 7، 8، 9، 10. النيكوتين يزيد من العدد الإجمالي للnAChRs تجميعها داخل الخلية، ويزيد الاتجار نحو غشاء البلازما، وهود يغير تجميع مفارز لصالح نسخة حساسية عالية لبعض أنواع فرعية. حل تغييرات واضحة في الاتجار، والتجمع، والتعبير عن مستقبلات في نموذج مرض توفر تفاصيل الآلية الحاسمة التي لا غنى عنها لتحديد أهداف المخدرات. شأن هذا النهج المثالي تفرق بسرعة بين مستقبلات الخلايا وتلك المترجمة على غشاء البلازما. هذا هو تحديا من نوع خاص في الحالات التي يكون فيها أغلبية من بروتين معين يتواجد داخل الخلية، كما هو الحال مع nAChRs. منذ يتم ترجمة معظم nAChRs إلى الشبكة الإندوبلازمية، والقياسات التقليدية تفتقر إلى الدقة المكانية والزمانية اللازمة لتحديد التغيرات التعريب والاتجار على طول مسار إفرازية. وقد أجريت في المقام الأول الاتجار مستقبلات والتعبير دراسات nAChRs باستخدام جين مشع ملزم 11، المقايسات biotinylation 12، الغربي النشاف 13، أو مناعي techniq UES 12. هذه تعتمد على خصوصية ربط جزيء مراسل أو تثبيت الخلايا وتفتقر إلى القدرة على التمييز بين وقت واحد مقيم غشاء البلازما ومستقبلات الخلايا. لذلك، اعتمدت الدراسات التجمع القناة الايونية والحويصلة ديناميات إلى حد كبير على الإنتاجية المنخفضة تقنيات الكهربية 14.
التحليل المكاني والزماني متفوقة ممكن مع التقدم في المجهر مضان. المشفرة وراثيا جزيئات المراسل، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ومشتقاته، والقضاء على القضايا ملزمة غير محددة وزيادة حساسية 15. والبديل حساسة درجة الحموضة من GFP، والمعروفة باسم pHluorin superecliptic (سبتمبر)، ويمكن استخدامها لاستغلال الخلافات الرقم الهيدروجيني المتأصلة بين المقصورات داخل الخلية لتحديد توطين 5، 7، 8،المرجع "> 9، 16، 17، 18. تتفلور سبتمبر عندما كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 6، لكنها لا تزال في حالة إيقاف في انخفاض الرقم الهيدروجيني. لذلك، تم الكشف عن مستقبلات ذات الكلمات الدلالية مع سبتمبر من جانبهم اللمعية عندما الحالي في الشبكة الإندوبلازمية ( ER) أو على الإدراج في غشاء البلازما (بعد الظهر)، ولكن ليس عندما يقتصر على الحويصلة الاتجار. التلاعب في الرقم الهيدروجيني خارج الخلية على اتصال مع المستقبلات على غشاء البلازما وبالتالي يغير مضان، وبالتالي الكشف عن هذه المستقبلات. إذا كان نفس الخلية والتقط بالتتابع في كل من الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة ومن ثم الرقم الهيدروجيني أقل من 6، ويعزى الفرق بين الصور إلى المستقبلات الموجودة على غشاء البلازما. هذا يسمح للقياس في وقت واحد من بين الخلايا (ER الطرفية) ومستقبلات البلازما غشاء مقيم 5، 7، 8 </suP> و 9. ويمكن أيضا أن تحل الأحداث حويصلة واحدة الإدراج عند الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة. مرة واحدة الصمامات منخفضة حويصلة الاتجار درجة الحموضة مع غشاء البلازما، يتعرض الجانب اللمعية من الحويصلة إلى حل خارج الخلية محايد، مما تسبب في انتقال الكشف عن موجة من مضان 7، 18، 19، 20. سبتمبر تمكن من قياس مستقبلات مترجمة إلى غشاء البلازما والشبكة الإندوبلازمية الطرفية، ويوفر وسيلة لقياس الاتجار من المستقبلات بين هذه المناطق التحت خلوية 5 و 7 و 18.
لتحقيق دقة أعلى في الغشاء البلازمي، وتصوير مستقبلات مع سبتمبر المشفرة وراثيا على مجموع المجهر التأمل الداخلي تنوير (TIRFM). هذه الطريقة بشكل خاصمفيدة إذا يتم ترجمة معظم المستقبلات المناطق داخل الخلايا، منذ TIRFM يزيد من وضوح غشاء البلازما. كما يتيح TIRFM القرار ديناميات الاتجار الحويصلات واحدة تحمل مستقبلات المسمى سبتمبر عليها الإدراج في PM. يحدث الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة المواد مع مؤشرات الانكسار مختلفة، مثل بين خلية وغطاء زجاجي الانزلاق 21، 22. تتفلور سبتمبر عندما المشع مع 488 نانومتر الإثارة، الموجه لتحقيق الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة من الحل الزجاج والخلية. وهذا ينتج موجة زائل التي تخترق ما يقرب من 150 نانومتر في العينة، فقط fluorophores مثيرة داخل هذا المجلد. تم الكشف فقط سبتمبر تحتوي على مستقبلات في بيئة درجة الحموضة محايدة ضمن هذا النطاق من الإثارة، مماثلة لتلك الموجودة على الغشاء البلازمي أو الشبكة الإندوبلازمية الطرفية. منذ الكشف محدودة ريتم تخفيض س الإثارة من موجة زائل، مضان الخلفية من منطقة داخل الخلايا وإشارة إلى نسبة الضوضاء يتم زيادة 21 و 22. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الإشعاع لا تخترق الجزء الأكبر من الخلايا، والتقليل photodamage الذي يتيح تصوير الخلايا الحية على مدار الساعة. ونتيجة لذلك، TIRFM مقرونا المشفرة وراثيا يوفر سبتمبر عالية الدقة والحساسية اللازمة لقياس التحت خلوية التعريب والاتجار ديناميات مستقبلات غشاء على طول مسار إفرازية.
Protocol
Representative Results
Discussion
حساسية درجة الحموضة من سبتمبر تمكن مستقبلات المقيمين على غشاء البلازما لتمييزها عن مستقبلات الخلايا في الشبكة الإندوبلازمية، ويمكن استخدامه لحل أحداث الإدراج من مستقبلات تحمل الحويصلات 5، 7، 8، 9?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60x, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25×36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
References
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer’s and Parkinson’s disease–a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. . Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
