Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Summary

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Abstract

Entendimento tráfico de membrana proteína, reunião e expressão requer uma abordagem que diferencia entre aqueles que residem em organelas intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. medidas tradicionais baseados em fluorescência não têm a capacidade de distinguir as proteínas da membrana que residem em diferentes organelos. metodologias de ponta transcender os métodos tradicionais por acoplamento fluoróforos sensíveis ao pH com microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). TIRF iluminação excita a amostra até cerca de 150 nm a partir da interface de amostra de vidro, diminuindo, assim, o fundo, aumentando a relação sinal-ruído, e aumentando resolução. O volume de excitação em TIRFM abrange a membrana plasmática e organelas nas proximidades, tal como o ER periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) é uma versão sensível ao pH da GFP. Geneticamente que codifica setembro para o domínio extracelular de uma proteína de membrana de interesse posiciona o fluoróforo sobreo lado luminal do RE e na região extracelular da célula. Setembro é fluorescente quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado a valores de pH mais baixos. Portanto, os receptores marcados com fluorescência quando setembro residente no retículo endoplasmático (ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico ou outros organelos tais como Golgi. O pH extracelular pode ser ajustado para ditar a fluorescência de receptores na membrana plasmática. A diferença na fluorescência entre as imagens TIRF a pH extracelular neutros e ácidos para a mesma célula corresponde a um número relativo de receptores na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de receptores residentes intracelulares e de membrana de plasma. eventos de inserção de vesículas standard também pode ser medida quando o pH extracelular é neutra, correspondendo a uma vesícula de baixo pH o tráfico de fusão com a membrana plasmática e a transição para um estado fluorescente. este versatile técnica pode ser explorada para estudar a localização, a expressão, e o tráfico de proteínas de membrana.

Introduction

As alterações na expressão do receptor, distribuição e montagem ter sido ligado a uma grande variedade de doenças, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, fibrose cística, e dependência de drogas ^{1, 2, 3, 4, 5.} Por exemplo, a nicotina e outros ligandos nicotínicos influenciar o tráfico de receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR) que conduzem a mudanças no tráfico, expressão, e regulação positiva ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} A nicotina aumenta o número total de nAChRs montados dentro de uma célula, aumenta tráfico para a membrana plasmática, umad altera a montagem de subunidades para favorecer uma versão de alta sensibilidade de alguns subtipos. Resolvendo alterações distintas no tráfico, montagem e expressão de receptores em um modelo de doença fornece detalhes mecanicistas cruciais que são essenciais para definir alvos de drogas. Uma abordagem ideal seria rapidamente diferenciar entre receptores intracelulares e as localizadas na membrana plasmática. Isto é particularmente difícil nos casos em que uma maior parte de uma proteína particular reside intracelularmente, tais como com os nAChRs. Uma vez que a maioria dos nAChRs são localizados no retículo endoplasmático, as medidas tradicionais não têm a resolução espaço-temporal necessário para identificar alterações de localização e de tráfico ao longo da via secretora. Tráfico receptor e estudos de expressão de nAChRs foram essencialmente realizados utilizando radioligandos de ligação ^{11, 12} Os ensaios de biotinilação, Western blotting ^13, ou imunoprecipitação Techniq ues ^12. Estes dependem da especificidade de ligação de uma molécula repórter ou a fixação das células e não têm a capacidade de distinguir entre simultaneamente membrana plasmática residente e receptores intracelulares. Portanto, estudos de montagem canal iônico e vesículas dinâmica em grande parte contou com baixo rendimento técnicas eletrofisiológicas ^14.

resolução espacial e temporal superior é possível com os avanços na microscopia de fluorescência. Moléculas repórter codificados geneticamente, tais como a proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes, eliminar os problemas de ligação não específicos e aumentar a sensibilidade ^15. Uma variante sensível ao pH da GFP, conhecido como pHluorin superecliptic (SEP), pode ser utilizada para explorar as diferenças inerentes entre os compartimentos de pH dentro de uma célula para determinar a localização ^{5, 7, 8,}Ref "> ^{9, 16, 17, 18.} setembro fluoresce quando o pH é maior do que 6, mas permanece num estado desligado, a pH baixo. Assim, os receptores marcados com setembro do seu lado luminal são detectados quando presente no retículo endoplasmático ( ER) ou após a inserção na membrana do plasma (PM), mas não quando confinado a uma vesícula de tráfico. a manipulação do pH extracelular em contacto com receptores na membrana plasmática, por conseguinte, altera a fluorescência e, portanto, a detecção destes receptores. Se a mesma célula é fotografada sequencialmente a ambos um pH extracelular neutra e, em seguida, um pH inferior a 6, a diferença entre as imagens é atribuída a receptores localizados na membrana plasmática. Isto permite a medição simultânea de intracelular (ER periférica) e receptores de membrana residentes de plasma ^{5, 7, 8} </su^{p>, 9.} eventos de inserção de vesículas standard também pode ser resolvido quando o pH extracelular é neutro. Uma vez que um baixo pH tráfico de vesículas funde com a membrana plasmática, o lado luminal da vesícula é exposto à solução extracelular neutro, fazendo com que uma transição detectado como uma explosão de fluorescência ^{7, 18, 19, 20.} Setembro permite a medição dos receptores localizados na membrana plasmática e do retículo endoplasmático periférica, e proporciona um meio para medir o tráfico de receptores entre estas regiões subcelulares ^{5, 7, 18.}

Para alcançar maior resolução na membrana plasmática, um receptor com a SEP geneticamente codificado é fotografada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM). Este método é particularmenteútil se a maioria dos receptores são localizada em regiões intracelulares, uma vez que TIRFM aumenta a visibilidade da membrana do plasma. TIRFM também permite a resolução da dinâmica do tráfico de vesículas simples que transportem receptores SEP-marcados mediante inserção no PM. A reflexão interna total ocorre na interface entre materiais com diferentes índices de refracção, tal como entre uma célula e uma lamela de vidro ^{21, 22.} Setembro fluoresce quando irradiado com 488 nm de excitação, que é orientada para alcançar reflexão interna total na interface da solução de vidro e de células. Isto produz uma onda evanescente que penetra cerca de 150 nm para a amostra, apenas fluoróforos excitantes no interior deste volume. Apenas setembro contendo receptores num ambiente de pH neutro dentro desta gama de excitação são detectados, correspondentes àqueles que residem na membrana plasmática ou retículo endoplasmático periférica. Uma vez que a detecção é limitado tO excitação por onda evanescente, a fluorescência de fundo da região intracelular é reduzida e a relação sinal-ruído é aumentada ^{21, 22.} Além disso, uma vez que a radiação não penetra na massa da célula, fotodano é minimizado o que permite imagens de células vivas ao longo do tempo. Como resultado, acoplado com TIRFM geneticamente codificado setembro fornece a alta resolução e sensibilidade requerida para medir a localização subcelular e tráfico dinâmica de receptores da membrana ao longo da via secretora.

Protocol

1. Cultura de Células e Transfecção Manter as células do rato neuroblastoma 2a (N2a) em meio de crescimento. Adicione 500 ml N2a meio de crescimento a partir de 200 ml de meio de Eagle da Dulbecco (DMEM) com elevado teor de glucose, 250 ml de meio de soro reduzido, 50 ml de soro fetal de bovino (FBS), e 5 mL de penicilina / estreptomicina (100x). Manter as células num frasco de T75 a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. células divididas 1:15, qua…

Representative Results

Setembro incorporação num receptor permite a detecção directa de que o receptor de uma célula viva. Juntamente com TIRFM, isto permite a avaliação dos níveis de expressão relativa na membrana do plasma e a distribuição de receptores dentro dos locais subcelulares na região de excitação TIRF. eventos individuais tráfego de vesículas pode também ser resolvido. Níveis de expressão relativa de receptores SEP-marcad…

Discussion

A sensibilidade de setembro pH permite receptores que residem na membrana plasmática de ser distinguido de receptores intracelulares no retículo endoplasmático, e pode ser usado para resolver eventos de inserção de vesículas ^{5, 7, 8, 9, 18, 19, 20} receptor de transporte . Várias téc…

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25